@mastersthesis {26446,
	title = {Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnol{\'o}gicos},
	year = {2019},
	type = {Tese de Doutorado},
	abstract = {Nos {\'u}ltimos anos o aumento do excedente de produ{\c c}{\~a}o do glicerol bruto, um subproduto da produ{\c c}{\~a}o do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplica{\c c}{\~a}o do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnol{\'o}gicos onde o glicerol {\'e} convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como {\'u}nica fonte de carbono, atrav{\'e}s do isolamento e caracteriza{\c c}{\~a}o do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estrat{\'e}gias de engenharia gen{\'e}tica foram tamb{\'e}m utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua convers{\~a}o em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpress{\~a}o simult{\^a}nea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimila{\c c}{\~a}o do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metab{\'o}lico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi tamb{\'e}m sobrexpresso o fator de transcri{\c c}{\~a}o/ativador Pdc2 que controla v{\'a}rios genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicol{\'\i}tico para a fermenta{\c c}{\~a}o. Todas as constru{\c c}{\~o}es foram confirmadas por amplifica{\c c}{\~a}o de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, n{\~a}o tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modifica{\c c}{\~o}es gen{\'e}ticas, sugerindo uma diminui{\c c}{\~a}o de fitness proporcional. Em colabora{\c c}{\~a}o com o Laborat{\'o}rio Nacional de Ci{\^e}ncia e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a an{\'a}lises filogen{\'e}ticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com \%CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90\% de extens{\~a}o e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma cont{\'e}m todas as sequ{\^e}ncias de prote{\'\i}nas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a constru{\c c}{\~a}o. A caracteriza{\c c}{\~a}o do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 {\textpm} 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta al{\'e}m da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 {\textpm} 10,16 μmol{\textperiodcentered}h-1{\textperiodcentered}g-1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O car{\'a}ter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonion{\'o}foro carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metab{\'o}licas de glicerol em leveduras ser{\~a}o necess{\'a}rios para que novas estrat{\'e}gias de engenharia gen{\'e}tica sejam mais eficientes.},
	url = {http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10813},
	author = {Aureliano Claret da Cunha}
}
