@mastersthesis {26455,
	title = {Regula{\c c}{\~a}o do transporte de lactose em Kluyveromyces lactis JA6},
	year = {2013},
	type = {Disserta{\c c}{\~a}o de mestrado},
	abstract = {Kluyveromyces lactis {\'e} uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso {\'e} considerada como modelo alternativo para estudos bioqu{\'\i}micos, fisiol{\'o}gicos e gen{\'e}ticos de leveduras n{\~a}o Saccharomyces. Compreender os mecanismos de capta{\c c}{\~a}o de lactose e a regula{\c c}{\~a}o envolvida no transporte {\'e} um passo importante para melhores aplica{\c c}{\~o}es biotecnol{\'o}gicas destas c{\'e}lulas. O transporte de lactose, em K. lactis {\'e} mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As c{\'e}lulas foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3\% w/w)) a uma concentra{\c c}{\~a}o de 2\% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 {\textdegree} C. As c{\'e}lulas foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por tr{\^e}s vezes com {\'a}gua fria, resuspensas em 100 mM Tris / tamp{\~a}o de citrato, pH 5.0 para medi{\c c}{\~o}es de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cin{\'e}tica da taxa inicial de capta{\c c}{\~a}o de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentra{\c c}{\~o}es de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p tamb{\'e}m foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as c{\'e}lulas foram cultivadas em lactose e divididas em duas al{\'\i}quotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As c{\'e}lulas foram colhidas, lavadas e a capta{\c c}{\~a}o inicial de lactose foi medida. A taxa de capta{\c c}{\~a}o inicial de [D-glucose-1-14C] lactose tamb{\'e}m foi investigada em c{\'e}lulas cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presen{\c c}a / aus{\^e}ncia de cicloheximida ou Higromicina B. A localiza{\c c}{\~a}o do transportador Lac12-GFP foi investigada em c{\'e}lulas crescidas em glicose e em c{\'e}lulas transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de a{\c c}{\'u}cares por c{\'e}lulas de K.lactis foi analisado atrav{\'e}s de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em c{\'e}lulas cultivadas em 2\% de lactose obedece a uma cin{\'e}tica de satura{\c c}{\~a}o. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 {\textpm} 0,38 mM e a velocidade m{\'a}xima (Vm{\'a}x) foi 953,47 {\textpm} 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em c{\'e}lulas cultivadas em galactose e glicerol. As c{\'e}lulas cultivadas em 2\% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as c{\'e}lulas crescidas em glicose foram transferidas para 2\% (w/v) de lactose, o transporte exibe recupera{\c c}{\~a}o parcial. Esta recupera{\c c}{\~a}o n{\~a}o parece requerer a s{\'\i}ntese de prote{\'\i}nas uma vez que cicloheximida e higromicina B n{\~a}o impediram a desrepress{\~a}o parcial. Al{\'e}m disso, o transporte de lactose n{\~a}o {\'e} inativado pela glicose. A localiza{\c c}{\~a}o sub celular do transportador Lac12 {\'e} dependente da fonte de carbono e da sua concentra{\c c}{\~a}o. O consumo de glicose e lactose {\'e} simult{\^a}neo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose {\'e} preferencial ao de galactose quando os dois a{\c c}{\'u}cares est{\~a}o presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 {\'e} constitutivo e que a glicose exerce um controle n{\~a}o muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.},
	url = {https://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/6554},
	author = {Ana Maria dos Santos}
}
