@mastersthesis {26468,
	title = {Estrat{\'e}gia para a identifica{\c c}{\~a}o de prote{\'\i}na(s) quinase(s) envolvida(s) na ativa{\c c}{\~a}o da H+- ATPase de membrana plasm{\'a}tica de Saccharomyces cerevisiae.},
	year = {2011},
	type = {Disserta{\c c}{\~a}o de mestrado},
	abstract = {A H+-ATPase de membrana plasm{\'a}tica de Saccharomyces cerevisiae {\'e} uma bomba de pr{\'o}tons que possui um papel importante na fisiologia deste microrganismo, uma vez que ativada {\'e} capaz de criar um gradiente eletroqu{\'\i}mico que {\'e} essencial para a capta{\c c}{\~a}o de nutrientes. A presen{\c c}a de glicose desencadeia modifica{\c c}{\~o}es p{\'o}s-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laborat{\'o}rio demonstraram que a ativa{\c c}{\~a}o da enzima, induzida por glicose, est{\'a} de alguma maneira ligada ao metabolismo de c{\'a}lcio. No entanto, a identidade da(s) prote{\'\i}na quinase(s) que leva {\`a} ativa{\c c}{\~a}o da enzima ainda n{\~a}o foi identificada. Neste trabalho, n{\'o}s mostramos os resultados de uma triagem com as cepas de levedura que apresentam dele{\c c}{\~o}es {\'u}nicas em genes que codificam para prote{\'\i}nas quinases existentes em Saccharomyces cerevisiae. Para isso, foi avaliada a varia{\c c}{\~a}o do pH extracelular durante o crescimento celular, com adi{\c c}{\~a}o de glicose, de leveduras apresentando dele{\c c}{\~o}es {\'u}nicas em genes que codificam para prote{\'\i}nas quinases conhecidas. As c{\'e}lulas foram cultivadas em placas de 96 po{\c c}os em YPD 2\%, e cada cultura foi avaliada com o indicador {\'a}cido-base p{\'u}rpura de bromocresol. Nossos resultados demonstraram que das 95 amostras analisadas, 53 foram incapazes de promover a acidifica{\c c}{\~a}o durante o crescimento celular. Quando a ativa{\c c}{\~a}o induzida por glicose foi medida por meio da determina{\c c}{\~a}o da acidifica{\c c}{\~a}o extracelular, apenas 20 mutantes apresentaram uma clara redu{\c c}{\~a}o na taxa de acidifica{\c c}{\~a}o, quando comparados {\`a} linhagem selvagem. Para eliminar as quinases que poderiam estar indiretamente envolvidas na regula{\c c}{\~a}o da ATPase, a sinaliza{\c c}{\~a}o de c{\'a}lcio foi medida e 14 mutantes apresentaram n{\'\i}veis de c{\'a}lcio normais durante a sinaliza{\c c}{\~a}o induzida por glicose. Posteriormente, n{\'o}s determinamos as propriedades cin{\'e}ticas da enzima, em membranas plasm{\'a}ticas purificadas, de mutantes com dele{\c c}{\~a}o em genes que codificam para 7 das 14 prote{\'\i}nas selecionadas como potenciais candidatas ao mecanismo de fosforila{\c c}{\~a}o da H+-ATPase, incluindo a cepa selvagem correspondente. No entanto, essa abordagem n{\~a}o permitiu esclarecer completamente a(s) identidade(s) da(s) prote{\'\i}na(s) quinase(s) que leva(m) {\`a} ativa{\c c}{\~a}o da H+-ATPase de membrana plasm{\'a}tica de Saccharomyces cerevisiae.},
	url = {https://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2689},
	author = {Renata Rebeca Pereira}
}
