Tese de Doutorado

A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.

A qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.

O bioetanol é um produto de grande importância econômica, principalmente devido a sua utilização como combustível renovável. A levedura Saccharomyces cerevisiae utiliza a sacarose obtida da cana-de-açúcar para produzir bioetanol por fermentação. Alguns fatores diminuem a capacidade fermentativa dessa levedura, por exemplo, a presença de Al3+ no caldo de cana-de-açúcar, levando a um aumento do tempo de fermentação e menor produção de bioetanol. Este trabalho teve como objetivo realizar a análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae utilizando a técnica de mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Locus). Uma triagem entre 840 estirpes de leveduras isoladas de diferentes ambientes foi feita a fim de selecionar uma altamente tolerante ao alumínio. Dentre as estirpes testadas, a levedura denominada Bruggeman Fresh apresentou crescimento e melhor desempenho fermentativo em presença de 5 mM de Al2(SO4)3. A estirpe PE-2, amplamente utilizada na produção de etanol pela indústria brasileira, apresentou uma maior sensibilidade ao alumínio. Estas duas leveduras, Bruggeman Fresh e PE-2, foram escolhidas para a estratégia de análise poligênica para o fenótipo de resistência ao alumínio adotada neste estudo. Após esporulação e dissecação das tétrades, os parentais superior e inferior foram selecionados e cruzados dando origem ao híbrido diploide. Foi realizado um pré-teste em meio sólido contendo alumínio com 658 segregantes obtidos a partir desse híbrido diploide, sendo que 150 segregantes foram selecionados e submetidos ao teste fermentativo. A partir do teste da performance fermentativa em presença de Al2(SO4)3, 30 segregantes foram selecionados como fenótipo superior (alta tolerância ao alumínio). Foi realizada a extração do DNA genômico desses 30 segregantes agrupados e 120 segregantes não selecionados (agrupados randomicamente), assim como das estirpes parentais superior e inferior e sequenciadas. A partir das análises das sequências e mapeamento de QTL foi encontrada uma região no cromossomo VI com grande ligação ao fenótipo de interesse, observado devido à diferença na frequência dos SNPs entre os grupos selecionado e não selecionado. Após a análise de reciprocidade hemizigótica, foi identificado que o gene FAB1 tem um importante papel sobre a tolerância ao alumínio em S. cerevisiae.

Em leveduras, como em outros eucariotos, o cálcio desempenha um papel essencial nas vias de sinalização celular. No entanto, até agora, a influência do cálcio na ativação de H+-ATPase de membrana citoplasmática induzida por glicose, uma via essencial para a fisiologia de leveduras, não foi demonstrada apesar de muitas evidências sugerirem que o cálcio é um fator primordial envolvido na ativação de H+-ATPase. H+-ATPase é uma proteína de membrana citoplasmática essencial para criar um gradiente de H+, utilizado para o transporte de nutrientes e homeostase do pH. A ativação de H+-ATPase é regulada pela atividade de diferentes proteínas como proteases, quinases e canais iônicos. Neste trabalho, foi demonstrada a relação entre a atividade de Lpx1p, uma serino-protease essencial para a ativação induzida por glicose de H+-ATPase de membrana citoplasmática, e o cálcio. Mutantes lpx1Δ exibiram um sinal de cálcio intracelular que não foi afetado enquanto a atividade de bombeamento de prótons foi reduzida, indicando sua essencialidade na ativação de H+-ATPase. Além disso, o aumento da atividade de bombeamento de prótons foi observado quando Lpx1p foi expresso em células lpx1Δ por meio de um vetor de expressão induzível. Em testes in vitro, a atividade proteolítica de Lpx1p aumentou na presença de cálcio. Dos ensaios in vitro, estabelecidos neste trabalho, foi demonstrado que Lpx1p, Ptk2p e cálcio são elementos-chave para a ativação de H+- ATPase. Esses resultados fortalecem um modelo em que a ativação pós-traducional de H+-ATPase induzida pela glicose e a sinalização de cálcio intracelular, estão realmente conectadas. Lpx1p seria este elo, aparentemente, dependendo da presença de cálcio para ser ativada e hidrolisar tubulinas acetiladas ligadas à H+-ATPase, permitindo a liberação da cauda C-terminal para fosforilação e ativação.

A cachaça é uma bebida destilada obtida do mosto de caldo de cana fermentado e surgiu no início da colonização quando a produção de açúcar era uma das principais atividades econômicas do Brasil. O processo produtivo da cachaça de alambique se divide em duas etapas, sendo que primeiramente faz-se o preparo do inóculo, conhecido como “pé-decuba”, e a segunda etapa refere-se à fermentação propriamente dita, onde ocorre o metabolismo do açúcar pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, formando álcool, dióxido de carbono e compostos secundários. Durante o cultivo da cana-de-açúcar, matéria prima utilizada para extração do caldo para fermentação, práticas de cultivo, como adubações nitrogenadas e capinas químicas são executadas; já no preparo do pé-de-cuba produtos de origem vegetal, como fubá de milho e quirela de arroz, são rotineiramente incorporados. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da adubação nitrogenada e uso de herbicida no cultivo da cana-de-açúcar, da adição de cereais e do tratamento térmico do caldo sobre a fermentação e a composição química da cachaça. Inicialmente foi implantada no IFNMG-Campus Salinas uma área de aproximadamente 1,0 hectare com a cana híbrida RB765418. Posteriormente este canavial foi subdividido em parcelas e aplicadas todas as práticas de cultivo de capinas manual e químicas versus adubações com sulfato de amônio e uréia, totalizando oito tratamentos. Para avaliar os efeitos destas práticas de cultivo sobre a fermentação do mosto em escala piloto, foram utilizados oito dornas de fermentação de 50L, em ambiente controlado, contendo em cada uma caldo de cana-de-açúcar extraído das plantas de seus respectivas tratamentos e uma cepa de Saccharomyces cerevisiae selecionada da região de Salinas/MG, durante 10 dias consecutivos. Para avaliar os efeitos do fubá de milho e da quirela de arroz foram utilizadas quatro dornas de fermentação e para o tratamento térmico mais três dornas, todas conduzidas nas mesmas condições anteriores. Foram analisados parâmetros fermentativos como o consumo de sólidos solúveis totais, grau alcoólico e acidez total do mosto. A dorna com mosto proveniente de caldo de cana submetidas às práticas de cultivo: fertilização com sulfato de amônio e capina química apresentou uma elevação na acidez. Não houve diferença significativa entre a dorna controle (somente a levedura) e as dornas com adição de fubá de milho e quirela de arroz. Em relação ao tratamento térmico do caldo, independente do método de tratamento, as dornas apresentaram um menor consumo de sólidos solúveis totais (ºBrix), indicando uma fermentação mais lenta, e redução do grau alcoólico. Especificamente para a dorna com caldo pasteurizado houve uma elevação da acidez do mosto. Para os parâmetros físico-químicos foi constatada uma maior produção de álcool n-propanol nas dornas, cujo caldo foi extraído de canas submetidas a capina química, e quando associada à fertilização com sulfato de amônio houve redução na produção de álcool isoamílico. Foi verificado que o uso do fubá de milho e da quirela de arroz não interferiu nos parâmetros físico-químicos das cachaças destiladas. O tratamento térmico, independente do método empregado, reduziu a formação do álcool isoamílico das cachaças destiladas. Portanto, foi constatado que as práticas de cultivo e a adição de suplementos nutricionais utilizados neste trabalho, bem como o tratamento térmico do caldo de cana, não resultaram em benefícios que justifiquem suas aplicações na busca de incrementos e melhorias sobre a fermentação e a composição química da cachaça.

A fermentação é uma etapa importante no processo de produção da cachaça, conduzida por microrganismos como leveduras e bactérias, responsáveis pela produção dos principais compostos presentes na bebida. As leveduras, notadamente a Saccharomyces cerevisiae, são as principais responsáveis pela condução desta etapa. Dentre as bactérias presentes, as bactérias lácticas são as mais comumente isoladas. Estas bactérias tem sido descritas por causarem prejuízos à fermentação mas também relata-se sua importância na melhoria sensorial de vinhos, pelo do aumento de ésteres, em especial o lactato de etila. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da presença de bactérias lácticas isoladas da região de Salinas/MG no processo fermentativo conduzido por uma levedura selecionada, assim como nas características físico-químicas e sensoriais da bebida. Inicialmente foram isoladas bactérias lácticas oriundas de dornas de fermentação de produtores de cachaça da região de Salinas/MG para posterior caracterização molecular. A caracterização molecular foi realizada por análise de restrição enzimática (PCRARDRA) e confirmada pelo sequenciamento da região intergênica 16S-23S, identificando bactérias da espécie Lactobacillus casei e Lactobacillus perolens em apenas um isolado. Estes isolados foram submetidos a testes de crescimento, viabilidade e produção de lactato de etila para escolha da melhor bactéria para uso nos experimentos de fermentação em escala piloto. Para avaliar o efeito desta bactéria sobre a fermentação da cachaça, foram utilizadas quatro dornas de 50L, em ambiente controlado, contendo caldo de cana-de-açúcar de uma mesma cultivar e uma Saccharomyces cerevisiae selecionada da região de Salinas/MG, durante 10 dias consecutivos. Variou-se somente a presença, o inoculo e reinóculos da bactéria láctica, assim como o uso de caldo esterilizado. Foram analisados parâmetros fermentativos como a taxa de consumo de sólidos solúveis totais, grau alcoólico e acidez total do mosto. Não houve diferença significativa entre as dornas controle (somente levedura) e as dornas com adição de bactéria láctica (0h, reinóculos de 48h e caldo autoclavado com reinóculos), não afetando assim o desempenho da fermentação. Entretanto a dorna com reinóculos de bactéria a cada 48 horas utilizando caldo estéril teve um pior desempenho a partir do quinto dia, indicando uma fermentação mais lenta. Para os parâmetros físicoquímicos foi constatado que houve maior produção de lactato de etila na dorna com caldo autoclavado e reinóculos da bactéria láctica, mostrando que somente a adição e os reinóculos da bactéria não garantem necessariamente uma maior presença do lactato de etila. Pode-se constatar que a relação entre a cepa de levedura e a espécie de bactéria láctica é fator importante para a presença do éster em estudo. Os resultados de acidez volátil da cachaça indicam que a adição e os reinóculos de Lactobacillus casei não interferem nesse parâmetro e mostram que a autoclavagem do caldo gera uma cachaça mais ácida. Os resultados dos testes de aceitação das cachaças produzidas indicaram que os inóculos e reinóculos de Lactobacillus casei, assim como o tratamento térmico do caldo, não interferem na percepção sensorial dos atributos analisados pelos julgadores e consumidores.

Cachaça é a bebida alcoólica destilada mais consumida no Brasil. O aumento do consumo no mercado interno e a possibilidade de ampliação da exportação exigem um produto padronizado de qualidade. Por conseguinte, a busca pela qualidade exige procedimentos técnicos em toda cadeia de suprimentos, desde a plantação da cana-deaçúcar até práticas de destilação, incluindo a qualidade do processo de fermentação, inoculação de estirpes apropriadas em concentração adequada, reciclagem controlada e condições ambientais, todos são importantes para atingir essa padronização. Este trabalho visou à caracterização molecular e bioquímica de linhagens de Saccharomyces cerevisiae da região de Salinas (MG) para fins de Identificação Geográfica. Assim, foi isolado 7680 linhagens oriundas de 14 alambiques da microrregião de Salinas (MG), das quais selecionamos 18 linhagens de S. cerevisiae com características desejáveis para a produção de cachaça conforme metodologia desenvolvida (INPI-MG Protocolo-315). As linhagens selecionadas foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). Das dezoito linhagens selecionadas, 15 linhagens foram submetidas a um experimento em escala piloto, usando dornas com capacidade de 40 L por 10 ciclos consecutivos, avaliando o desempenho fermentativo como: consumo de sólidos solúveis, teor alcoólico e acidez do vinho, bem como os compostos voláteis presentes no produto final a cachaça. Das 15 linhagens testadas foram selecionadas seis para avaliar a repetibilidade dos resultados no ano seguinte. Das seis linhagens selecionadas, duas linhagens apresentaram melhor desempenho fermentativo e foram testadas em escala de produção, usando dornas com capacidade de 800 L, para avaliar o desempenho em escala de produção e a qualidade do produto final. Posteriormente as linhagens foram analisadas quanto à produção de alcoóis superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as linhagens produzem elevada quantidade de álcool superior. Foi realizado teste de aceitação das cachaças produzidas com as linhagens selecionadas. Para a caracterização molecular das linhagens em estudo, o polimorfismo do DNA das linhagens foi analisado com as técnicas de RAPD-PCR, COX-PCR e análises de microssatélites. Nossos resultados demonstraram que a análise de microssatélites permitiu uma nítida distinção dentre as linhagens analisadas, ao contrário das técnicas de RAPD-PCR e COX-PCR. Demonstrando, assim, ser necessário o uso de diferentes técnicas combinadas na análise do polimorfismo das linhagens. A caracterização molecular mostrou um polimorfismo entre as linhagens selecionadas e claras diferenças sobre linhagens isoladas de outras regiões de Minas Gerais, sugerindo uma forte correlação entre a origem geográfica e as características genéticas de linhagens de leveduras.

A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma enzima muito importante, pois pelo bombeamento de prótons para fora da célula, ela cria um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, é dependente do metabolismo de cálcio e que nesta via, o sensor Snf3p, parece atuar de forma paralela a Gpa2p, e que sua cauda C-terminal é aparentemente responsável por este papel. Neste trabalho, nós observamos que em baixas concentrações de cálcio externo, o sinal de cálcio, e consequentemente a ativação induzida por glicose, da H+- ATPase de membrana plasmática, é independente da atividade de proteínas responsáveis pela captação de cálcio em S. cerevisiae. Nesta condição, as células parecem ser capazes de detectar as baixas concentrações de cálcio externo e de alguma forma controlar a atividade da Ca2+- ATPase vacuolar, Pmc1p. Nós apresentamos dados que sugerem que Yvc1p, um canal de cálcio de membrana vacuolar está envolvido no sinal de cálcio induzido por glicose em células de levedura. Além disso, trabalhando com a droga 2-aminoetoxidifenil borato (2-APB), um modulador de receptores de IP3 em células de mamíferos, fomos capazes de demonstrar que provavelmente o Yvc1p funcione como um receptor de IP3 ou pelo menos responda a um componente, ainda desconhecido, sensível ao mesmo, no sinal de cálcio induzido por açúcar. Nossos resultados também sugerem que Snf3p deve regular negativamente a atividade da Ca2+- ATPase, Pmc1p, inibindo o sequestro de cálcio citosólico. Investigando os braços paralelos que regulam nossa via de estudo, observamos no duplo mutante snf3Δplc1Δ, surpreendentemente, uma reversão dos fenótipos observados nos mutantes únicos. Este comportamento pode ser explicado pelo fato de que neste mesmo duplo mutante há uma ausência de acúmulo de cálcio e então as condições de concentração e localização deste íon sejam favoráveis a uma ativação normal da H+-ATPase . Finalmente, nós demonstramos que a proteína quinase C parece estar envolvida no sinal de cálcio induzido por açúcar em células de levedura. Muito provavelmente ela participe do controle da H+-ATPase de membrana plasmática pela regulação dos níveis de cálcio e não pela fosforilação direta da enzima.

A levedura Saccharomyces cerevisiae possui uma via MAP quinase de transdução de sinais composta por Pkc1p, Bck1p, Mkk1p e Mkk2p, e Mpk1p. Já foi descrito que esta via está envolvida no controle da integridade da parede celular, na resposta ao estresse osmótico, no crescimento de pseudo-hifas e no controle do metabolismo de carbono. Neste trabalho investigamos a participação de Pkc1p no controle da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono. Para isto, fizemos uma analise da expressão gênica global através de microarranjos de DNA comparando a resposta global sob condições de repressão e desrepressão metabólica no mutante a pkc1∆ e na cepa selvagem correspondente W303. Os resultados obtidos indicaram uma diferença significativa na expressão global dos genes nas duas cepas analisadas. Vinte e oito genes envolvidos no metabolismo de carbono foram selecionados para validação por RT-PCR e os resultados confirmaram que sete genes foram mais expressos na cepa W303 quando comparada com a cepa e quatro genes foram mais expressos na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem. Análises “In silico” apontaram três fatores de transcrição Sok2p, Crz1p and Gcr1p, que podem estar envolvidos no controle da expressão gênica por Pkc1p. Experimentos utilizando plasmídeos contendo o gene da β- galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram que a expressão destes genes se apresentava diminuída na cepa pkc1∆ para o gene HXT1, aumentada para o gene CYC1 e igual para o gene SUC2 quando comparada com a cepa selvagem W303. A atividade de Invertase apresenta-se significativamente diminuída na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem W303. Nossos resultados confirmam a participação da proteína Pkc1p na regulação da expressão gênica durante o processo de desrepressão metabólica.

Com o objetivo de caracterizar molecularmente a cepa Saccharomyces cerevisiae LBCM 427, selecionada a partir de dornas de fermentação de cachaça, utilizaram-se várias metodologias de análise de polimorfismo de DNA para permitir a discriminação entre esta e as cepas presentes no local de origem. Os resultados demonstraram que RAPD-PCR, mtDNA, e PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não foram suficientes para uma boa diferenciação entre a cepa LBCM 427 e cepas isoladas na mesma dorna de fermentação. Por outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação com base no perfil cromossomal permitiu uma nítida distinção entre o grupo de cepas analisadas. Estes resultados demonstram que o uso de cepas iniciadoras requer um acompanhamento com o uso combinado de métodos bioquímicos e moleculares. A cepa parenteral LBCM 427, foi segregada e as tétrades analisadas quanto a estabilidade fisiológica e bioquímica em passagens sucessivas. Avaliaram-se os seguintes parâmetros floculação, não produção de H2S, resistência a 5,5´,5´´-trifluoro-DLleucina (TFL) e cerulenina, crescimento em diferentes condições de pressão osmótica e de temperatura. Os resultados demonstraram que nenhuma cepa segregante reuniu todas as características da cepa parental. Diante disto, foi selecionada uma cepa segregante que atendia ao critério de resistência a TFL e cerulenina para analisar o comportamento em uma fermentação em caldo de cana e possíveis mutações no gene LEU4 que transcreve para a - isopropilmalato sintase. Esta segregante não foi afetada na presença de altas concentrações de L-leucina (20 mM) e, apresentou mutações no gene LEU4 ainda não descritas pela literatura. A cepa LBCM 427 e segregante foram avaliadas quanto à produção de cachaça em escala piloto. Os parâmetros analisados foram: o perfil químico da bebida produzida e a adaptação das cepas em condições similares às encontradas na fabricação artesanal da cachaça. Por cromatografia gasosa, quantificaram-se os compostos voláteis sendo estes o acetaldeído, acetato de etila, metanol, n-propanol, isobutanol, álcool isoamílico, e furfural. Verificou-se que as cepas LBCM 427 e segregante produzem elevados teores de álcool isoamílico e álcool isobutílico quando comparadas a uma cepa Saccharomyces cerevisiae comercial utilizada como controle. Outra cepa utilizada como controle do processo, a cepa nativa LBCM 422, sensível a ambos compostos, produziu quantidades semelhantes de álcool isoamílico quando comparada às cepas LBCM 427 e segregante, resistentes a TFL e cerulenina. Os resultados apresentados oferecem uma importante contribuição para o desenvolvimento de novas estratégias de seleção de cepas selvagem com características específicas, levando a produção da cachaça com maior produção de compostos flavorizantes.