Dissertação de Mestrado

A cerveja é uma das bebidas alcoólicas mais consumidas no mundo, fazendo parte da cultura da maioria das civilizações. A produção de cerveja é resultado do metabolismo das leveduras que, a partir dos açúcares presentes no mosto, formam dois produtos principais: etanol e dióxido de carbono – processo denominado fermentação. Além disso, há, geralmente, a formação de pequenas quantidades de outros componentes, chamados compostos secundários. A qualidade sensorial de bebidas fermentadas está intimamente relacionada com as concentrações equilibradas dos seus compostos secundários. Além das leveduras, bactérias lácticas também podem ser utilizadas na fermentação de bebidas, contribuindo para a qualidade sensorial do produto final. A influência dessa fermentação consorciada foi estudada na produção de uísque, vinho e cachaça, sendo seu maior benefício a produção do éster lactato de etila. Este éster, formado pela esterificação do etanol com o ácido láctico, contribui para o aroma e sabor da bebida devido ao seu caráter frutado. Os estudos já realizados com fermentação consorciada na produção de cerveja estão relacionados às cervejas Lambic, cuja fermentação acontece espontaneamente por microrganismos presentes no ambiente produtivo. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma cerveja a partir do inóculo controlado de Lactobacillus brevis em consórcio com a levedura Saccharomyces cerevisiae, a fim de avaliar a contribuição das bactérias lácticas sobre as características sensoriais do produto final. As quatro cepas de L. brevis (LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720) tiveram sua capacidade de crescimento avaliado em diferentes temperaturas (15°C e 20°C), sendo que a 20°C o desempenho observado foi mais próximo à temperatura controle (30°C). As fermentações entre os quatro isolados de L. brevis em consórcio com a levedura S. cerevisiae LBCM1078 foram realizadas, primeiramente, em escala laboratorial, em meio sintético YP maltose 2%, onde foi possível avaliar o desempenho fermentativo dos microrganismos, bem como a produção de ácido láctico, ácido acético e lactato de etila. Também foi avaliado o desempenho fermentativo desses consórcios em extrato de malte 16%, comparando-se dois momentos do inóculo das bactérias lácticas: início ou final da fermentação alcoólica. As cepas LBCM718 e LBCM720, quando inoculadas no início da fermentação alcoólica, se destacaram quanto à produção de lactato de etila, sendo, portanto, selecionadas para a etapa de produção de cerveja em maior escala. Foram produzidas três cervejas utilizando consórcio entre LBCM1078 e LBCM718, consórcio entre LBCM1078 e LBCM720 e fermentação controle, somente com a levedura LBCM1078. Foram avaliados os seguintes parâmetros do produto final: álcoois superiores, ésteres de acetato, ésteres de ácido graxo de cadeia média, etanol, pH e lactato de etila. As cervejas produzidas em consórcio com bactérias apresentaram maiores concentrações de lactato de etila e isobutanol e menores concentrações de acetaldeído. Além disso, não houve prejuízo quanto ao conteúdo de etanol, pelo inóculo de bactérias. Os resultados apresentados nesse trabalho sugerem que as bactérias lácticas podem ser uma nova alternativa para a produção de cerveja com alto padrão de qualidade, uma vez que tais microrganismos são conhecidos como seguros e podem contribuir para o aroma do produto.

A H+-ATPase de membrana plasmática, codificada pelo gene PMA1, é responsável pela formação de um gradiente eletroquímico de prótons que possibilita o controle do pH intracelular e a captação de nutrientes pela célula. A Pma1p é ativada na presença de glicose e várias proteínas estão envolvidas nesse processo, modulando de forma direta ou indireta, a atividade desta enzima. Estudos prévios, realizados em diferentes background de S. cerevisiae, correlacionaram vários genes envolvidos na atividade da Pma1p, mas ainda não foi elucidado o papel de cada um deles nesta via de ativação, bem como a relação deles em cada background estudado. No presente trabalho foi realizada a construção de múltiplos mutantes para os genes PMC1, SNF3 e ARG82 em dois diferentes background de S. cerevisiae (BY4741 e PJ69) a fim de ampliar o conhecimento dos mecanismos envolvidos na via de sinalização da ativação da H+-ATPase mediada por glicose. Para isso, foram realizados procedimentos de acidificação celular do meio, determinação da disponibilidade de cálcio intracelular e avaliação da sensibilidade ao antibiótico higromicina B e ao alumínio. Os resultados do presente trabalho confirmaram a importância dos genes ARG82, PMC1 e SNF3 na regulação da atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, em S. cerevisiae. Foram verificadas variações na disponibilidade de cálcio citosólico e na atividade de Pma1p entre os mutantes construídos. Aparentemente, a proteína Arg82p, dentre as três proteínas estudadas neste trabalho, possui um papel mais importante na ativação da enzima Pma1p, seja na: (i) modulação do cálcio intracelular, (ii) na acidificação do meio, (iii) na sensibilidade à higromicina e ao alumínio, e (iv) na capacidade fermentativa das células. Contudo, apesar da importância do cálcio como regulador intracelular na atividade de Pma1p, não foi verificada uma relação direta entre a concentração de cálcio citosólico e a atividade de Pma1p sugerindo que outros fatores possam estar envolvidos. Ademais, os diferentes resultados encontrados, nos diferentes backgrounds, demonstraram que o efeito das mutações poderia ser dependente da linhagem analisada.

A H+-ATPase de membrana citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae mantem o gradiente eletroquímico necessário para o transporte de íons, de nutrientes essenciais e pelo controle do pH interno. A ativação da H+-ATPase da membrana citoplasmática em S. cerevisiae induzida pela glicose é dependente de cálcio e o metabolismo do fosfatidilinositol parece estar envolvida neste processo de ativação da enzima. A proteína Arg82 p é uma inositol quinase que tem como uma das suas funções fosforilar o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) em inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (IP4) e inositol 1,3,4,5,6-pentafosfato (IP5) considerados importantes mensageiros na regulação da homeostase de Ca2+ citosólico. O mutante arg82 da linhagem de S. cerevisiae PJ69 apresenta uma atividade da H+-ATPase superior a linhagem selvagem, indicando uma relação da ausência dessa proteína com o aumento nas concentrações de IP3 e de cálcio citosólico com subsequente ativação da H+-ATPase. Curiosamente, esse efeito não é observado com o mesmo mutante obtido para a linhagem BY4742. Para estudar essa aparente contradição foram realizados cruzamentos o mutante arg82 do background PJ69 (apresentando maior ativação da Pma1 p induzida por glicose) e a estirpe selvagem do background BY4742 (com menor ativação da Pma1), com posterior seleção de segregantes que possuem os fenótipos similares ao da linhagem parental superior (arg82 do background PJ69). Após cruzamento dessas linhagens, 600 segregantes F1 foram testados quanto à suscetibilidade ao antibiótico higromicina e ao cloreto de lítio. Aproximadamente 34 segregantes que apresentaram comportamento similar ao parental superior foram selecionados para análise da acidificação induzida por glicose para confirmação da maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose. Dentre esses segregantes, vinte com fenótipo superior podem ser utilizados para o mapeamento de QTLs relacionados à maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose na linhagem S. cerevisiae PJ694a.

Na fabricação de cervejas estilos Ale ou Lager, são utilizadas leveduras pertencentes às espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. As cepas do estilo Lager fermentam em baixas temperaturas, produzem menores concentrações de compostos responsáveis por aroma e são consideradas de baixa fermentação, por flocularem. As cepas do estilo Ale fermentam a temperaturas mais elevadas, produzem altas concentrações de alcoóis superiores e ésteres e são consideradas de alta fermentação. O objetivo deste trabalho foi estudar a capacidade de esporulação, a característica reprodutiva, assim como a aplicação de técnicas de cruzamentos entre leveduras isoladas de dornas de fermentação da cachaça para a obtenção de novas estirpes com potencial para produção de cerveja. Das 128 cepas de leveduras caracterizadas quanto à freqüência e eficiência da esporulação, 121 leveduras (95%) apresentaram esporulação acima de 50%, sendo que quatorze não foram capazes de esporular. Vinte e quatro cepas apresentaram viabilidade de esporos acima de 91% e sete cepas não apresentaram viabilidade dos esporos. Apenas, três cepas de leveduras foram classificadas como heterotálicas: LBCM1073, LBCM1078 e LBCM1115. A partir dos resultados apresentados e de outros resultados do nosso grupo de pesquisa, como a caracterização da produção de compostos responsáveis pelo aroma, capacidade de fermentação de açúcares e de floculação, duas cepas foram selecionadas para cruzamentos. A cepa LBCM1078 apresenta capacidade de fermentação de maltose e alta produção de compostos responsáveis por aroma, enquanto a cepa LBCM1092 apresenta uma floculação constitutiva. A partir das duas técnicas de cruzamento desenvolvidas, entre células haplóides e entre células diplóides, 21 e 33 híbridos foram obtidos, respectivamente. Os híbridos foram avaliados quanto à capacidade de fermentação de maltose e a capacidade de floculação, sendo selecionadas três novas cepas para futuros experimentos de fermentação em condições similares à produção de cerveja.

Existem micro-organismos capazes de utilizar o glicerol como fonte de carbono e energia, sendo assim, bastante atrativos como bioconversores do glicerol bruto gerado a partir da produção de biodiesel. Em Saccharomyces cerevisiaea via de metabolização do glicerol é bem definida, em que um sistema simporte de prótons, codificado pelo gene STL1, é preferencialmente utilizado na captação do glicerol quando fontes fermentáveis de carbono não estão presentes. O presente trabalho objetivou identificar o gene STL1 que codifica um provável transportador de glicerol em Wickerhamomyces anomalus LBCM105, cujo o genoma ainda não se encontra disponível em banco de dados. O gene identificado apresentou 1443 pb e 480 aminoácidos. A análise in sílico comparativa da região promotora identificou fatores de transcrição putativos associados à regulação de STL1 de W. anomalus LBCM105 e S. cerevisiae, sugerindo uma notável distinção entre os elementos putativos de ambos. A análise da arvore filogenética, construída a partir das sequências de proteínas Stl1 de diferentes leveduras, evidenciou uma maior similaridade entre o transportador putativo de W. anomalus LBCM105 e W. ciferrii, e uma maior distância em relação a S. cerevisiae. Após caracterização do gene STL1 de W. anomalus LBCM105, foram realizados análises da expressão gênica deste em condições de cultivo contendo glicose ou glicerol, como fonte de carbono. O gene STL1 apresentou uma expressão 23,76 vezes maior em glicerol em relação à condição de meio contendo glicose. A avaliação do transporte de glicerol pela W. anomalus LBCM105 evidenciou um transporte ativo em condições de cultivo contendo glicose ou glicerol, no entanto, Stl1p foi induzida em presença de glicerol. Os resultados apresentaram dados relevantes quanto à possível identificação do transportador de glicerol em W. anomalus LBCM105, evidenciando um potencial significativo na aplicação biotecnológica quanto ao consumo de glicerol bruto, resíduo da indústria de biodiesel, uma vez que demonstrou ser bastante eficiente na captação de glicerol.

Os biocombustíveis, bioetanol e biodiesel, estão entre as fontes de energia alternativas promissoras para reduzir a utilização dos combustíveis fósseis. O biodiesel é um éster metílico ou etílico obtido a partir da transesterificação de óleos vegetais na presença de um álcool. Esta reação gera como subproduto, o glicerol bruto (GB), que equivale a 10% de todo volume gerado. Uma alternativa para o consumo do GB é a sua utilização como fonte de carbono por micro-organismos oleaginosos. Os óleos estocados podem ser utilizados como uma fonte alternativa de óleos para produção do biodiesel. Os micro-organismos oleaginosos são capazes de acumular mais de 20% de sua biomassa em lipídeos e seus óleos apresentam estrutura química semelhante aos óleos vegetais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi selecionar leveduras capazes de metabolizar o glicerol bruto e estocá-lo na forma de lipídeos. Sessenta e três isolados de leveduras oriundas da produção de cachaça foram avaliados quanto à capacidade de crescer na presença de GB, como única fonte de carbono, e armazená-lo na forma de lipídeos. As leveduras foram inoculadas em meio mínimo Synthetic Defined (SD) contendo 10% de GB e incubadas a 23°C, durante um período de 48 horas. No ensaio colorimétrico com Sudan Black (corante lipofílico) as culturas foram fixadas em lâminas e analisadas em microscópio óptico. Vinte e cinco cepas foram selecionadas como leveduras capazes de armazenar lipídeos. Posteriormente, estas cepas foram submetidas a ensaio quantitativo utilizando o corante fluorescente Nile Red. Para isso, foram inoculadas em meio SD com 10% de GB, incubadas a 28°C, sob agitação de 180 RPM, por 48 horas e colocadas em solução Nile Red 0,1 mg/mL por 10 minutos. Seis leveduras apresentaram o dobro da acumulação de lipídeo em comparação a Yarrowia lipolytica (controle positivo). Estas cepas foram posteriormente submetidas à caracterização dos ácidos graxos produzidos, na cromatografia gasosa-Flame Ionization Detector (CG-FID). A cepa LBCM3 apresentou o maior conteúdo lipídico dentre as selecionadas com 36,60% de lipídeos. Além disso, esta foi a única cepa capaz de produzir simultaneamente os ácidos linoléico e linolênico, lipídeos estes importantes para produção de biodiesel. A cepa LBCM17 apresentou o segundo maior conteúdo lipídico com 27,90% de lipídeos totais. As cepas LBCM95 e LBCM98 exibiram 21,90% e 2,17% de lipídeos totais, respectivamente. A LBCM1 apresentou o menor conteúdo lipidíco com 0,22% de lipídeos totais. Os resultados demonstram que as leveduras selecionadas são capazes de utilizar o GB como fonte de carbono e possuem potencial para aplicação na produção de biodiesel. As seis leveduras selecionadas na análise semi-quantitativa, segundo resultado do sequenciamento da região ITS5.8s, são Saccharomyces cerevisiae.

Para manter sua capacidade produtiva, as células de leveduras precisam adaptar-se às mudanças ambientais que ocorrem durante o processo produtivo. A resposta a baixo pH é de interesse, pois tal exposição ocorre sob condições industriais como no tratamento ácido para redução de contaminação bacteriana antes da reciclagem celular em processos fermentativos. Semelhante à resposta a ácidos orgânicos, a resistência a ácidos inorgânicos envolve mudanças da permeabilidade de membrana, extrusão ativa de H+ e modulação da expressão gênica. O presente trabalho estudou a participação do íon cálcio na resposta ao estresse ácido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos mostram elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ desencadeada por pulso ácido e que esta mudança decorre do influxo de cálcio extracelular e da mobilização vacuolar do íon. Testes de viabilidade celular sugerem que a tolerância da S. cerevisiae a estresse ácido envolve a ativação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e consequente regulação da expressão de alguns genes mediada pelo fator de transcrição Crz1p/Tcn1p. A tolerância dos mutantes nulos da via de sinalização da quinase Snf1p, responsável pela utilização de fontes alternativas de carbono, foi menor em relação à cepa parental BY4741, sugerindo a participação desta via na resposta a baixo pH. Em conjunto, os resultados mostram a importância das vias de sinalização da fosfatase calcineurina e da quinase Snf1p para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido.

Kluyveromyces lactis é uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso é considerada como modelo alternativo para estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos de leveduras não Saccharomyces. Compreender os mecanismos de captação de lactose e a regulação envolvida no transporte é um passo importante para melhores aplicações biotecnológicas destas células. O transporte de lactose, em K. lactis é mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As células foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3% w/w)) a uma concentração de 2% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 ° C. As células foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por três vezes com água fria, resuspensas em 100 mM Tris / tampão de citrato, pH 5.0 para medições de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cinética da taxa inicial de captação de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentrações de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p também foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as células foram cultivadas em lactose e divididas em duas alíquotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As células foram colhidas, lavadas e a captação inicial de lactose foi medida. A taxa de captação inicial de [D-glucose-1-14C] lactose também foi investigada em células cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presença / ausência de cicloheximida ou Higromicina B. A localização do transportador Lac12-GFP foi investigada em células crescidas em glicose e em células transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de açúcares por células de K.lactis foi analisado através de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em células cultivadas em 2% de lactose obedece a uma cinética de saturação. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 ± 0,38 mM e a velocidade máxima (Vmáx) foi 953,47 ± 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em células cultivadas em galactose e glicerol. As células cultivadas em 2% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as células crescidas em glicose foram transferidas para 2% (w/v) de lactose, o transporte exibe recuperação parcial. Esta recuperação não parece requerer a síntese de proteínas uma vez que cicloheximida e higromicina B não impediram a desrepressão parcial. Além disso, o transporte de lactose não é inativado pela glicose. A localização sub celular do transportador Lac12 é dependente da fonte de carbono e da sua concentração. O consumo de glicose e lactose é simultâneo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose é preferencial ao de galactose quando os dois açúcares estão presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 é constitutivo e que a glicose exerce um controle não muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.

Em processos fermentativos, as células de leveduras são expostas a alterações ambientais, tais como alterações nos níveis de nutrientes, temperatura, pH, concentração de etanol, concentração de O2, e outras mudanças. A capacidade de responder às condições ambientais é importante para a funcionalidade e sobrevivência das células. Na literatura, são amplamente discutidos os problemas relacionados à resposta ao estresse por ácidos orgânicos fracos produzidos durante o processo fermentativo ou aqueles utilizados como conservantes e à micro-organismos competidores. A resposta ao estresse induzido por ácidos inorgânicos é pouco estudada uma vez que este ambiente é encontrado quando se reciclam células em processos industriais e quando se utilizam leveduras como probiótico. O objetivo deste trabalho foi investigar a importância das reservas energéticas ATP, trealose e glicogênio, na resposta ao estresse ácido inorgânico em diferentes linhagens de Saccharomyces. Os resultados obtidos mostram que as linhagens de Saccharomyces cerevisiae: var. boulardii, LBCM 479 (ena1-4 ) e UFMG 905 submetidas a um estresse ácido severo (pH 2), imposto pelo ácido inorgânico HCl, são mais tolerantes a essa condição do que a S. cerevisiae W303, que apresentou maior sensibilidade. Foi observado um consumo de ATP e mobilização de trealose ao longo da exposição ao ácido em todas as linhagens. A reserva de glicogênio não pareceu ser importante para a resposta ao ácido, no período de ensaio analisado, quando a trealose ainda se encontrava presente. Os dados sugerem que um dos fatores envolvidos na resposta a este estresse, em relação à viabilidade celular, relaciona-se ao conteúdo/mobilização de reservas energéticas, especialmente, do dissacarídeo trealose. Interessantemente, a linhagem W303 mostrou aumento das reservas de trealose e uma maior capacidade de sobreviver ao estresse ácido quando exposta ao HCl antes e depois de um estresse térmico moderado em fases de crescimento exponencial e estacionária. Um aumento das reservas de glicogênio ocorreu após o estresse térmico subletal apenas na fase estacionária. Provavelmente, essa resposta envolve também mudanças na expressão gênica. A sobrevivência em mutantes nulos tps1(subunidade do complexo trealose fosfato sintase/fosfatase), nth1 e nth2 (genes das trealases neutras), ath1 (gene da trealase ácida), assim como a atividade enzimática sugerem que esses genes são importantes para a resposta ao estresse ácido inorgânico. Em conjunto, os resultados sugerem que o conteúdo e a mobilização de reservas energéticas, principalmente de trealose, parecem estar envolvidos na resposta ao estresse por ácido inorgânico. Além disso, células de W303 submetidas a um estresse de temperatura subletal respondem melhor ao estresse ácido e, esta resposta coincide com uma maior mobilização de trealose.

Etanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.

A cerveja é uma bebida alcoólica produto da fermentação do malte de cevada por leveduras que vem sendo produzida desde, aproximadamente, 6000 anos a.C. Além de gás carbônico e etanol, as leveduras produzem durante a fermentação, compostos secundários que são responsáveis pela formação do flavour e consequente qualidade sensorial da bebida. Por isso o uso de leveduras selecionadas tem sido um aspecto de grande importância na obtenção de bebidas. Na fabricação da cerveja, podem ser utilizadas leveduras do tipo ale ou lager, que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. Estas espécies podem ser classificadas tanto por testes bioquímicos quanto por seu comportamento diferencial durante a fermentação. O Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP conta com uma coleção de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas a partir de dornas de fermentação de cachaça, as quais foram selecionadas por sua alta capacidade de produção de compostos voláteis e alta resistência a diferentes tipos de estresse. O presente trabalho objetivou a caracterização bioquímica e molecular de 21 cepas da coleção LBCM e a utilização de critérios de seleção visando à aplicação destas cepas à produção de cervejas. Das 21 cepas estudadas, 11 foram capazes de fermentar maltose, apresentando velocidade específica de crescimento semelhante em meio contendo glicose. A identificação molecular das cepas através da região ITS-5.8S do rDNA confirmou que 10 cepas pertencem à espécie S. cerevisiae. Dois grupos de testes foram aplicados posteriormente sobre as 10 cepas selecionadas e 4 cepas cervejeiras comerciais. O primeiro grupo de testes incluiu critérios de seleção baseados na classificação ale e lager, no perfil de floculação e na capacidade de crescer sob baixas temperaturas. O segundo grupo, incluiu testes complementares baseados na tolerância ao etanol, na produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e 4-vinilguaiacol (4-VG), no transporte de α-glicosídeos e na síntese de micocinas. Os resultados mostraram que três das 10 cepas estudadas foram capazes de fermentar melobiose e secretar melobiase, perfil característico de cepas tipo lager, embora todas as cepas tenham crescido a 37°C. Além disso, 9 foram capazes de crescer a 20°C e 7 a 15°C. Quanto ao perfil de floculação, 9 cepas apresentaram percentuais de floculação maior que 36% e responderam com um fenótipo New-Flo. A presença dos genes FLO1, FLO5 e FLO11 foi verificada por PCR e quantificada por qPCR, sendo relevante a presença dos genes FLO5 e FLO11 na maioria das cepas. Em geral, as cepas mais floculantes foram também as que apresentaram maior hidrofobicidade na sua superfície celular. Quanto aos testes complementares, as cepas apresentaram resistência a altas concentrações de etanol (20% (v/v)), baixa ou nenhuma produção de H2S (off flavour) e síntese de 4-VG em concentrações semelhantes às apresentadas pelas cepas comerciais tipo ale. Considerando a importância do consumo total dos açúcares presentes no mosto, em especial a maltotriose, o transporte de α-glicosídeos foi avaliado. As cepas apresentaram um transporte de α-glicosídeos semelhante aos valores revelados pelas cepas cervejeiras comerciais. Finalmente, as cepas foram submetidas a testes de produção e resistência a micocinas, considerando o uso de fermentações consorciadas. Os resultados revelaram que todas as cepas experimentais não são sensíveis, tampouco prejudiciais a outras espécies. Com base nos resultados dos testes complementares, foram selecionadas as cepas experimentais LBCM 45 e 78 para a produção de cervejas german pilsner e weissbier, respectivamente. As cervejas produzidas foram submetidas a análises físico-químicas, cujos resultados mostraram que as cepas em estudo, LBCM 45 e 78 apresentaram comportamento semelhante às cepas cervejeiras comerciais W-34/70 e WB-06. Portanto, os resultados do presente trabalho contribuíram para uma melhor caracterização da grande diversidade de linhagens de S. cerevisiae isoladas da produção de cachaça, visando sua potencial utilização na produção de outras bebidas alcoólicas fermentadas, tais como as cervejas, além da sua possível utilização em fermentações consorciadas.

Em uma economia movida pelo transporte, a dinâmica dos combustíveis líquidos faz parte de sua engenharia. A mudança do consumo de energia baseado em combustíveis fósseis para os de fontes renováveis é um desafio e uma necessidade de ordem econômica e ambiental. Uma vez que o petróleo é a principal fonte fóssil utilizada e possui reservas de fácil acesso limitadas, o consumo destas irá eventualmente exaurir sua oferta. Uma alternativa que tem mostrado-se promissora nos últimos anos é o uso dos Biocombustíveis. Dentre estes, o maior destaque é dado ao Bioetanol e Biodiesel. A partir do processo produtivo de Biodiesel industrialmente utilizado são obtidos ésteres monoalquílicos de ácidos graxos (Biodiesel) e co-produtos dos quais o mais importante é o glicerol. Muitos microrganismos são capazes de utilizar o glicerol como única fonte de carbono, e um exemplo são as leveduras. O objetivo deste projeto foi desenvolver um processo, industrialmente vantajoso, para utilizar um co-produto de baixo custo da produção de Biodiesel como base para meio de cultura para diferentes leveduras. Utilizou-se três linhagens de interesse comercial, Saccharomyces cerevisiae LBCM 653C (produtora de cachaça) e do fermento de panificação FLEISHMANN, e S. boulardii, e uma linhagem laboratorial, S. cerevisiae BY4741. Cresceu-se essas linhagens em diluições de resíduo glicérico bruto de Biodiesel fornecido pelo CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais/Belo Horizonte-MG) e pela BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA/Itaúna-MG). As diluições foram acrescidas de diferentes fontes nitrogenadas (YP – Extrato de levedura e Peptona, Sulfato de Amônio e Uréia) e analisadas quanto ao crescimento celular. As preparações nas quais obteve-se crescimento celular similar àquele obtido em meio laboratorial YPGlicerol foi com o acréscimo de YP como fonte nitrogenada, e o crescimento celular em resíduo diluído com ou sem a adição Sulfato de Amônio e Uréia não foi apreciável quando comparado àquele obtido com YP. Análise dos dados mostrou que o crescimento celular em cada preparação de resíduo de Biodiesel diluído depende da linhagem utilizada. Sugere-se que a manutenção do pH em valores mais baixos estimule o crescimento celular em resíduo de Biodiesel diluído. Além disso, a estocagem parece promover modificações no resíduo que inibem o crescimento celular da linhagem S. boulardii sob as condições ensaiadas. Devido ao fato de que as leveduras estudadas foram capazes de crescer em diluições de resíduo de Biodiesel, a utilização deste em processo biotecnológico com leveduras é viável.

Cachaça é a bebida destilada mais consumida no Brasil, e a terceira mais consumida no mundo. O Brasil exporta este produto para 45 países, porém estas vendas não atingem 1% da produção nacional. Para incrementar a exportação é necessário que se atinja um novo patamar de qualidade. Tal qualidade pode ser alcançada pela utilização de Lactato de etíla leveduras selecionadas, que permitem a obtenção de estabilidade físico-química e sensorial, além de incremento do “flavour” devido à maior produção de compostos voláteis, especialmente álcoois superiores e ésteres. Um importante éster, o lactato de etila, é descrito como tendo caráter frutado e habilidade de mascarar o sabor vegetal residual da cachaça. Ele é formado pela esterificação do etanol com ácido lático, produzido por bactérias láticas (LABs), que por sua vez são consideradas contaminantes do processo. O objetivo deste trabalho é investigar se é possível a utilização de bactérias láticas em fermentação mista, para a produção de cachaça de alto padrão de qualidade, devido ao incremento nos teores do éster lactato de etila. Este trabalho utiliza uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae selecionada, a LBCM606, em associação a cada uma das quatro cepas bacterianas descritas entre os contaminantes mais comuns da fermentação da cachaça: Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum, além da cepa isolada de Yakult® Lactobacillus casei Shirota, utilizada como controle industrial, e duas cepas isoladas de dorna, bLBCM680-2 e bLBCM680-3. As fermentações mistas foram comparadas à fermentação tradicional. Alíquotas da fermentação foram retiradas nos tempos de 0, 2, 4, 6, 8, 24 e 48h e analisadas quanto ao pH e consumo de sacarose, e nos tempos 0, 24 e 48h quanto à população de células. Tais análises não forneceram evidências de que bactérias até a concentração de 106 UFC/ml possam prejudicar o processo produtivo da cachaça devido ao consumo de açúcares e queda da viabilidade de leveduras provocada por acidificação do meio. A dosagem de lactato de etila foi realizada por CG-MS nos tempos de 8, 24 e 48h de fermentação, e revelam um desempenho superior das cepas isoladas de dorna e, principalmente, do controle industrial, L. casei. Estas três cepas testadas sob a condição de reciclo de células, mantém a viabilidade de células bacterianas apenas ao longo dos três primeiros ciclos, sendo que no décimo ciclo, a contagem de células viáveis é menor que 0,5% da contagem do primeiro ciclo. A cepa bLBCM680-2 por possuir uma produção de lactato de etila mais estável ao longo dos ciclos, é a mais promissora para a utilização em dornas de produção de cachaça.

A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma bomba de prótons que possui um papel importante na fisiologia deste microrganismo, uma vez que ativada é capaz de criar um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, está de alguma maneira ligada ao metabolismo de cálcio. No entanto, a identidade da(s) proteína quinase(s) que leva à ativação da enzima ainda não foi identificada. Neste trabalho, nós mostramos os resultados de uma triagem com as cepas de levedura que apresentam deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases existentes em Saccharomyces cerevisiae. Para isso, foi avaliada a variação do pH extracelular durante o crescimento celular, com adição de glicose, de leveduras apresentando deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases conhecidas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços em YPD 2%, e cada cultura foi avaliada com o indicador ácido-base púrpura de bromocresol. Nossos resultados demonstraram que das 95 amostras analisadas, 53 foram incapazes de promover a acidificação durante o crescimento celular. Quando a ativação induzida por glicose foi medida por meio da determinação da acidificação extracelular, apenas 20 mutantes apresentaram uma clara redução na taxa de acidificação, quando comparados à linhagem selvagem. Para eliminar as quinases que poderiam estar indiretamente envolvidas na regulação da ATPase, a sinalização de cálcio foi medida e 14 mutantes apresentaram níveis de cálcio normais durante a sinalização induzida por glicose. Posteriormente, nós determinamos as propriedades cinéticas da enzima, em membranas plasmáticas purificadas, de mutantes com deleção em genes que codificam para 7 das 14 proteínas selecionadas como potenciais candidatas ao mecanismo de fosforilação da H+-ATPase, incluindo a cepa selvagem correspondente. No entanto, essa abordagem não permitiu esclarecer completamente a(s) identidade(s) da(s) proteína(s) quinase(s) que leva(m) à ativação da H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.

O bombeamento de prótons é um processo executado pela H+-ATPase de membrana plasmática Pma1p e é importante em Saccharomyces cerevisiae pois permite a captação de nutrientes através da criação de gradiente eletroquímico. Em presença de glicose esta enzima é ativada. Estudos preliminares mostram uma forte relação entre a presença de IP3, a liberação de cálcio vacuolar e ativação de Pma1p. Para a elucidação da via de liberação de cálcio faz-se necessária a identificação de proteínas receptoras de IP3 e suas relações que culminam neste processo. Com este objetivo nosso trabalho adotou duas estratégias independentes: a utilização de ensaio de afinidade seguida de tentativa de identificação por espectrometria de massas; e utilização de bancos de dados e recursos de bioinformática contígua a avaliações bioquímicas para uma identificação indireta através das interações descritas para Yvc1p, proteína responsável pela saída de cálcio. Na primeira estratégia, verificamos que os prováveis receptores de IP3 apresentam peso molecular entre 66 e 97 kDa, porém ainda não obtivemos a identificação por espectrometria de massas; na segunda estratégia, porém, chegamos a um grupo de seis proteínas (Yvc1p, Alg6p, Nmd2p, Mdm10p, Sse2p e Swc3p ) que estão relacionadas a liberação do cálcio vacuolar e que apresentam o peso molecular entre 66 e 97 kDa.

No Brasil, a cachaça é a mais popular bebida destilada produzida pela destilação de caldo de cana fermentado. A produção nacional é estimada em torno de 1,3 bilhões de litros por ano, dos quais menos de 1% é exportado. Como conseqüência desta pequena exportação, grandes esforços tem sido realizados para aumentar a qualidade deste produto e aumentar a participação deste produto no mercado internacional. Usualmente o processo de fermentação do caldo de cana é conduzido por uma sucessão de cepas de leveduras, sendo que a espécie de levedura predominante é a Saccharomyces cerevisiae. Na cachaça e em outras bebidas como o vinho, tem sido incorporado o uso de cepas selecionadas no processo fermentativo para melhorar as características das bebidas e gerar um produto de melhor qualidade. Neste trabalho, utilizamos quatro cepas oriundas de diferentes localidades geográficas, porém selecionadas e isoladas pelo mesmo procedimento conforme metodologia desenvolvida em nosso laboratório (INPI-MG Protocolo-315) que seleciona leveduras com características desejáveis para a produção de cachaça. Além destas cepas outras duas cepas previamente identificadas como resistente e sensível a cerulenina e TFL foram utilizadas nos experimentos. Neste trabalho, as cepas LBCM 600, LBCM 601, LBCM 613 e LBCM 632, selecionadas por tal metodologia foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). O polimorfismo do DNA das cepas foi analisado com as técnicas de RAPD-PCR, COX-PCR e análises de microssatélites. Nossos resultados demonstraram que a análise de microssatélites permitiu uma nítida distinção dentre todas as cepas analisadas, ao contrário das técnicas de RAPD-PCR e COX-PCR. Isto demonstrou ser necessário o uso de diferentes técnicas combinadas na análise do polimorfismo das cepas. Posteriormente as cepas foram analisadas quanto à produção de alcoóis superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as cepas produzem elevada quantidade de álcool isoamílico, octanoato e decanoato de etila. Por fim os genes BAP2, BAT1, BAT2, ATF2, ADH1 e EEB1 foram analisados em suas expressões por qRT-PCR. Ao contrário do esperado, nenhuma correlação direta pôde ser estabelecida entre o nível de expressão destes genes e a produção de compostos aromáticos. Os resultados demonstram que a metodologia de seleção desenvolvida precisa ser aperfeiçoada, sobretudo no que diz respeito à utilização de outras técnicas que possibilitem a identificação de características indicadoras por exemplo de uma maior capacidade de produção de compostos aromatizantes.

A H+-ATPase de membrana citoplasmática da levedura Saccharomyces cerevisiae é uma bomba de prótons que possui um papel essencial na fisiologia da levedura. A atividade desta enzima é regulada tanto a nível transcricional quanto a nível pós-transcricional e uma importante característica é o fato desta enzima ser ativada por glicose, baixo pH e por agentes despolarizantes. A via de ativação da H+-ATPase por agentes despolarizantes ainda não é conhecida. Neste trabalho sugerimos uma via de transdução de sinal semelhante a do fosfatidil inositol como parte do mecanismo de ativação ATPásica pelo Cianeto carbonil mclorofenilhidrazona. Nesta via esta droga ativaria a enzima fosfolipase C que hidrolisaria o fosfatidilinositol-bifosfato em dois componentes, diacilglicerol e inositol tri-fosfato. O inositol trifosfato gerado estaria desencadeando a mobilização de cálcio extracelular e de estoques intracelulares. O aumento dos níveis de cálcio livre citosólico, juntamente com a formação de diacilglicerol, poderia estar levando a ativação da proteína quinase C, que uma vez ativa, estaria fosforilando a H+-ATPase em dois resíduos de aminoácidos essenciais para a mudança conformacional da enzima, tornando-a ativa.

A proteína quinase C (Pkc1p) de Saccharomyces cerevisiae, codificada pelo gene PKC1, participa de uma cascata de MAPKinase denominada via de integridade celular ou via PKC-MAPKinase cuja principal função é a biosíntese da parede celular. Além disso, diversos processos celulares tem sido descritos como tendo a participação de Pkc1 p: a síntese de ribossomos, a realocação de fatores transcricionais como Mig1 p, a regulação da atividade de N-glicosilação, a fusão de membranas celulares, o crescimento polarizado e o controle da polarização do citoesqueleto de actina. O mutante pkc1Δ não é capaz de crescer em meio de cultura contendo glicerol como única fonte de carbono. Buscando elucidar as bases moleculares que explicam tal fenótipo, demonstramos nesse trabalho que pkc1Δ apresenta baixa atividade da enzima glicerol quinase quando comparada à cepa selvagem em virtude da menor expressão do gene GUT1 nesse mutante. Similarmente ao observado para o mutante pkc1Δ, o mutante gup1Δ apresenta fraco crescimento em fontes de carbono alternativas como etanol, glicerol e rafinose, e sensibilidade aos estresses ácido e oxidativo. A fraca performance em rafinose não está associada a uma baixa atividade da enzima invertase, enquanto a sensibilidade ao estresse ácido não deve estar relacionada à baixa atividade da enzima H+-ATPase. Como Gup1 p tem atividade de remodelase da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e considerando que essa atividade é importante para produção de proteínas GPI-ancoradas ativas, os fenótipos observados para o mutante gup1Δ podem estar relacionados a falta da atividade de remodelase nesse mutante. Embora os fenótipos dos mutantes pkc1Δ e gup1Δ sejam similares, o mutante pkc1Δ apresenta níveis de expressão do gene GUP1 comparáveis aos encontrados para a cepa selvagem.

Cachaça é a mais popular bebida destilada produzida no Brasil. Em Minas Gerais a atividade se encontra em expansão, com uma produção anual de cerca de 230 milhões de litros, sendo uma grande atividade econômica com boas perspectivas para o mercado externo. Usualmente o processo de fermentação do caldo de cana é conduzido por uma sucessão de cepas de leveduras, sendo que a espécie de levedura predominante é a Saccharomyces cerevisiae. O aroma e o sabor são características que influenciam, identificam e oferecem qualidade às bebidas fermentadas. Na cachaça, e em outras bebidas como o vinho, tem sido incorporado o uso de cepas selecionadas no processo fermentativo para melhorar as características das bebidas e gerar um produto de melhor qualidade. Neste trabalho, isolamos cepas de S. cerevisiae de diferentes regiões do estado de Minas Gerais, usando a nova metodologia (INPI-MG Protocolo-315) que seleciona leveduras com características desejáveis para a produção de cachaça. Assim, as cepas foram selecionadas seguindo critérios relevantes para a produção da bebida, como: não produção de H 2 S, tolerância a etanol e a temperaturas elevadas, capacidade fermentativa, floculação e produção de micocinas. As leveduras foram também expostas a drogas como TFL e cerulenina para identificar aquelas maiores produtoras de álcoois superiores e ésteres. As cepas selecionadas foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). Nos últimos anos, várias metodologias baseadas na análise do polimorfismo do DNA têm sido utilizadas para permitir a discriminação entre cepas inoculadas de cepas remanescentes presentes na flora indígena envolvidas no processo fermentativo. Em nossos resultados demonstramos que o RAPD-PCR utilizando primers baseados no sítio de splicing de introns e PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não são suficientes para permitir uma boa diferenciação entre as cepas selecionadas, porém estas técnicas permitiram a distinção entre diferentes espécies de leveduras pertencentes ao grupo Saccharomyces sensu stricto. Por outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação das cepas com base no perfil cromossomal, permitiu uma nítida distinção entre todas as cepas analisadas. Apesar do grande polimorfismo molecular encontrado não observamos correlação entre diversidade genética e localização geográfica. Posteriormente as cepas foram analisadas quanto a produção de álcoois superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as cepas produzem elevada quantidade de álcool isoamílico e caproato de etila. Os resultados demonstram que a metodologia utilizada é apropriada para a seleção de cepas com características adequadas para serem utilizadas na produção de cachaça de alambique. E que a utilização de cepas selecionadas como fermento iniciador requer o uso combinado de métodos bioquímicos e moleculares que possibilitem caracterizar e analisar a dinâmica das cepas selecionadas durante todo o processo fermentativo .

Em leveduras, a proteína quinase C participa da regulação da via bioquímica responsável pela transcrição de uma subunidade da enzima glucano sintase, a qual está envolvida na síntese da parede celular. A via PKC MAP quinase consiste das enzimas Bck1, Mkk1/2 e Mpk1 que são ativadas por fosforilação. Recentemente, nós descobrimos que o mutante pkc1 D, contrariamente aos demais mutantes da cascata Map quinase, exibe dois principais defeitos no controle do metabolismo de carbono. A cepa pkc1 D apresenta um atraso na iniciação da fermentação e um defeito na desrepressão após a exaustão de glicose do meio. Estes fatos são consistentes com a hipótese de que há uma bifurcação depois de Pkc1 p, sugerindo que esta proteína quinase possui varias funções importantes em levedura. Baseados na característica que o mutante pkc1D é incapaz de crescer em glicerol, nós isolamos um novo mutante da cepa pkc1 D que apresenta um crescimento normal em glicerol. O novo mutante (LBFM335) foi transformado com uma biblioteca genômica de levedura e nós isolamos dois transformantes (LBFM342 e LBFM342) que recuperaram o fenótipo original do mutante pkc1 D (incapacidade de crescer em glicerol). Neste trabalho, nós caracterizamos um novo mutante (LBFM 335) que alivia o fenótipo repressivo de pkc1 D em Sccharomyces cerevisiae . Além disso, nós isolamos dois supressores extragênicos desta mutação, que foram identificados como a exportina nuclear Msn5 e a histona deacetilase Hos2.