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Em uma economia movida pelo transporte, a dinâmica dos combustíveis líquidos faz parte de sua engenharia. A mudança do consumo de energia baseado em combustíveis fósseis para os de fontes renováveis é um desafio e uma necessidade de ordem econômica e ambiental. Uma vez que o petróleo é a principal fonte fóssil utilizada e possui reservas de fácil acesso limitadas, o consumo destas irá eventualmente exaurir sua oferta. Uma alternativa que tem mostrado-se promissora nos últimos anos é o uso dos Biocombustíveis. Dentre estes, o maior destaque é dado ao Bioetanol e Biodiesel. A partir do processo produtivo de Biodiesel industrialmente utilizado são obtidos ésteres monoalquílicos de ácidos graxos (Biodiesel) e co-produtos dos quais o mais importante é o glicerol. Muitos microrganismos são capazes de utilizar o glicerol como única fonte de carbono, e um exemplo são as leveduras. O objetivo deste projeto foi desenvolver um processo, industrialmente vantajoso, para utilizar um co-produto de baixo custo da produção de Biodiesel como base para meio de cultura para diferentes leveduras. Utilizou-se três linhagens de interesse comercial, Saccharomyces cerevisiae LBCM 653C (produtora de cachaça) e do fermento de panificação FLEISHMANN, e S. boulardii, e uma linhagem laboratorial, S. cerevisiae BY4741. Cresceu-se essas linhagens em diluições de resíduo glicérico bruto de Biodiesel fornecido pelo CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais/Belo Horizonte-MG) e pela BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA/Itaúna-MG). As diluições foram acrescidas de diferentes fontes nitrogenadas (YP – Extrato de levedura e Peptona, Sulfato de Amônio e Uréia) e analisadas quanto ao crescimento celular. As preparações nas quais obteve-se crescimento celular similar àquele obtido em meio laboratorial YPGlicerol foi com o acréscimo de YP como fonte nitrogenada, e o crescimento celular em resíduo diluído com ou sem a adição Sulfato de Amônio e Uréia não foi apreciável quando comparado àquele obtido com YP. Análise dos dados mostrou que o crescimento celular em cada preparação de resíduo de Biodiesel diluído depende da linhagem utilizada. Sugere-se que a manutenção do pH em valores mais baixos estimule o crescimento celular em resíduo de Biodiesel diluído. Além disso, a estocagem parece promover modificações no resíduo que inibem o crescimento celular da linhagem S. boulardii sob as condições ensaiadas. Devido ao fato de que as leveduras estudadas foram capazes de crescer em diluições de resíduo de Biodiesel, a utilização deste em processo biotecnológico com leveduras é viável.

Cachaça é a bebida destilada mais consumida no Brasil, e a terceira mais consumida no mundo. O Brasil exporta este produto para 45 países, porém estas vendas não atingem 1% da produção nacional. Para incrementar a exportação é necessário que se atinja um novo patamar de qualidade. Tal qualidade pode ser alcançada pela utilização de Lactato de etíla leveduras selecionadas, que permitem a obtenção de estabilidade físico-química e sensorial, além de incremento do “flavour” devido à maior produção de compostos voláteis, especialmente álcoois superiores e ésteres. Um importante éster, o lactato de etila, é descrito como tendo caráter frutado e habilidade de mascarar o sabor vegetal residual da cachaça. Ele é formado pela esterificação do etanol com ácido lático, produzido por bactérias láticas (LABs), que por sua vez são consideradas contaminantes do processo. O objetivo deste trabalho é investigar se é possível a utilização de bactérias láticas em fermentação mista, para a produção de cachaça de alto padrão de qualidade, devido ao incremento nos teores do éster lactato de etila. Este trabalho utiliza uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae selecionada, a LBCM606, em associação a cada uma das quatro cepas bacterianas descritas entre os contaminantes mais comuns da fermentação da cachaça: Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum, além da cepa isolada de Yakult® Lactobacillus casei Shirota, utilizada como controle industrial, e duas cepas isoladas de dorna, bLBCM680-2 e bLBCM680-3. As fermentações mistas foram comparadas à fermentação tradicional. Alíquotas da fermentação foram retiradas nos tempos de 0, 2, 4, 6, 8, 24 e 48h e analisadas quanto ao pH e consumo de sacarose, e nos tempos 0, 24 e 48h quanto à população de células. Tais análises não forneceram evidências de que bactérias até a concentração de 106 UFC/ml possam prejudicar o processo produtivo da cachaça devido ao consumo de açúcares e queda da viabilidade de leveduras provocada por acidificação do meio. A dosagem de lactato de etila foi realizada por CG-MS nos tempos de 8, 24 e 48h de fermentação, e revelam um desempenho superior das cepas isoladas de dorna e, principalmente, do controle industrial, L. casei. Estas três cepas testadas sob a condição de reciclo de células, mantém a viabilidade de células bacterianas apenas ao longo dos três primeiros ciclos, sendo que no décimo ciclo, a contagem de células viáveis é menor que 0,5% da contagem do primeiro ciclo. A cepa bLBCM680-2 por possuir uma produção de lactato de etila mais estável ao longo dos ciclos, é a mais promissora para a utilização em dornas de produção de cachaça.

A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma bomba de prótons que possui um papel importante na fisiologia deste microrganismo, uma vez que ativada é capaz de criar um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, está de alguma maneira ligada ao metabolismo de cálcio. No entanto, a identidade da(s) proteína quinase(s) que leva à ativação da enzima ainda não foi identificada. Neste trabalho, nós mostramos os resultados de uma triagem com as cepas de levedura que apresentam deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases existentes em Saccharomyces cerevisiae. Para isso, foi avaliada a variação do pH extracelular durante o crescimento celular, com adição de glicose, de leveduras apresentando deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases conhecidas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços em YPD 2%, e cada cultura foi avaliada com o indicador ácido-base púrpura de bromocresol. Nossos resultados demonstraram que das 95 amostras analisadas, 53 foram incapazes de promover a acidificação durante o crescimento celular. Quando a ativação induzida por glicose foi medida por meio da determinação da acidificação extracelular, apenas 20 mutantes apresentaram uma clara redução na taxa de acidificação, quando comparados à linhagem selvagem. Para eliminar as quinases que poderiam estar indiretamente envolvidas na regulação da ATPase, a sinalização de cálcio foi medida e 14 mutantes apresentaram níveis de cálcio normais durante a sinalização induzida por glicose. Posteriormente, nós determinamos as propriedades cinéticas da enzima, em membranas plasmáticas purificadas, de mutantes com deleção em genes que codificam para 7 das 14 proteínas selecionadas como potenciais candidatas ao mecanismo de fosforilação da H+-ATPase, incluindo a cepa selvagem correspondente. No entanto, essa abordagem não permitiu esclarecer completamente a(s) identidade(s) da(s) proteína(s) quinase(s) que leva(m) à ativação da H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.

O bombeamento de prótons é um processo executado pela H+-ATPase de membrana plasmática Pma1p e é importante em Saccharomyces cerevisiae pois permite a captação de nutrientes através da criação de gradiente eletroquímico. Em presença de glicose esta enzima é ativada. Estudos preliminares mostram uma forte relação entre a presença de IP3, a liberação de cálcio vacuolar e ativação de Pma1p. Para a elucidação da via de liberação de cálcio faz-se necessária a identificação de proteínas receptoras de IP3 e suas relações que culminam neste processo. Com este objetivo nosso trabalho adotou duas estratégias independentes: a utilização de ensaio de afinidade seguida de tentativa de identificação por espectrometria de massas; e utilização de bancos de dados e recursos de bioinformática contígua a avaliações bioquímicas para uma identificação indireta através das interações descritas para Yvc1p, proteína responsável pela saída de cálcio. Na primeira estratégia, verificamos que os prováveis receptores de IP3 apresentam peso molecular entre 66 e 97 kDa, porém ainda não obtivemos a identificação por espectrometria de massas; na segunda estratégia, porém, chegamos a um grupo de seis proteínas (Yvc1p, Alg6p, Nmd2p, Mdm10p, Sse2p e Swc3p ) que estão relacionadas a liberação do cálcio vacuolar e que apresentam o peso molecular entre 66 e 97 kDa.