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A cachaça é uma bebida destilada obtida do mosto de caldo de cana fermentado e surgiu no início da colonização quando a produção de açúcar era uma das principais atividades econômicas do Brasil. O processo produtivo da cachaça de alambique se divide em duas etapas, sendo que primeiramente faz-se o preparo do inóculo, conhecido como “pé-decuba”, e a segunda etapa refere-se à fermentação propriamente dita, onde ocorre o metabolismo do açúcar pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, formando álcool, dióxido de carbono e compostos secundários. Durante o cultivo da cana-de-açúcar, matéria prima utilizada para extração do caldo para fermentação, práticas de cultivo, como adubações nitrogenadas e capinas químicas são executadas; já no preparo do pé-de-cuba produtos de origem vegetal, como fubá de milho e quirela de arroz, são rotineiramente incorporados. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da adubação nitrogenada e uso de herbicida no cultivo da cana-de-açúcar, da adição de cereais e do tratamento térmico do caldo sobre a fermentação e a composição química da cachaça. Inicialmente foi implantada no IFNMG-Campus Salinas uma área de aproximadamente 1,0 hectare com a cana híbrida RB765418. Posteriormente este canavial foi subdividido em parcelas e aplicadas todas as práticas de cultivo de capinas manual e químicas versus adubações com sulfato de amônio e uréia, totalizando oito tratamentos. Para avaliar os efeitos destas práticas de cultivo sobre a fermentação do mosto em escala piloto, foram utilizados oito dornas de fermentação de 50L, em ambiente controlado, contendo em cada uma caldo de cana-de-açúcar extraído das plantas de seus respectivas tratamentos e uma cepa de Saccharomyces cerevisiae selecionada da região de Salinas/MG, durante 10 dias consecutivos. Para avaliar os efeitos do fubá de milho e da quirela de arroz foram utilizadas quatro dornas de fermentação e para o tratamento térmico mais três dornas, todas conduzidas nas mesmas condições anteriores. Foram analisados parâmetros fermentativos como o consumo de sólidos solúveis totais, grau alcoólico e acidez total do mosto. A dorna com mosto proveniente de caldo de cana submetidas às práticas de cultivo: fertilização com sulfato de amônio e capina química apresentou uma elevação na acidez. Não houve diferença significativa entre a dorna controle (somente a levedura) e as dornas com adição de fubá de milho e quirela de arroz. Em relação ao tratamento térmico do caldo, independente do método de tratamento, as dornas apresentaram um menor consumo de sólidos solúveis totais (ºBrix), indicando uma fermentação mais lenta, e redução do grau alcoólico. Especificamente para a dorna com caldo pasteurizado houve uma elevação da acidez do mosto. Para os parâmetros físico-químicos foi constatada uma maior produção de álcool n-propanol nas dornas, cujo caldo foi extraído de canas submetidas a capina química, e quando associada à fertilização com sulfato de amônio houve redução na produção de álcool isoamílico. Foi verificado que o uso do fubá de milho e da quirela de arroz não interferiu nos parâmetros físico-químicos das cachaças destiladas. O tratamento térmico, independente do método empregado, reduziu a formação do álcool isoamílico das cachaças destiladas. Portanto, foi constatado que as práticas de cultivo e a adição de suplementos nutricionais utilizados neste trabalho, bem como o tratamento térmico do caldo de cana, não resultaram em benefícios que justifiquem suas aplicações na busca de incrementos e melhorias sobre a fermentação e a composição química da cachaça.

A fermentação é uma etapa importante no processo de produção da cachaça, conduzida por microrganismos como leveduras e bactérias, responsáveis pela produção dos principais compostos presentes na bebida. As leveduras, notadamente a Saccharomyces cerevisiae, são as principais responsáveis pela condução desta etapa. Dentre as bactérias presentes, as bactérias lácticas são as mais comumente isoladas. Estas bactérias tem sido descritas por causarem prejuízos à fermentação mas também relata-se sua importância na melhoria sensorial de vinhos, pelo do aumento de ésteres, em especial o lactato de etila. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da presença de bactérias lácticas isoladas da região de Salinas/MG no processo fermentativo conduzido por uma levedura selecionada, assim como nas características físico-químicas e sensoriais da bebida. Inicialmente foram isoladas bactérias lácticas oriundas de dornas de fermentação de produtores de cachaça da região de Salinas/MG para posterior caracterização molecular. A caracterização molecular foi realizada por análise de restrição enzimática (PCRARDRA) e confirmada pelo sequenciamento da região intergênica 16S-23S, identificando bactérias da espécie Lactobacillus casei e Lactobacillus perolens em apenas um isolado. Estes isolados foram submetidos a testes de crescimento, viabilidade e produção de lactato de etila para escolha da melhor bactéria para uso nos experimentos de fermentação em escala piloto. Para avaliar o efeito desta bactéria sobre a fermentação da cachaça, foram utilizadas quatro dornas de 50L, em ambiente controlado, contendo caldo de cana-de-açúcar de uma mesma cultivar e uma Saccharomyces cerevisiae selecionada da região de Salinas/MG, durante 10 dias consecutivos. Variou-se somente a presença, o inoculo e reinóculos da bactéria láctica, assim como o uso de caldo esterilizado. Foram analisados parâmetros fermentativos como a taxa de consumo de sólidos solúveis totais, grau alcoólico e acidez total do mosto. Não houve diferença significativa entre as dornas controle (somente levedura) e as dornas com adição de bactéria láctica (0h, reinóculos de 48h e caldo autoclavado com reinóculos), não afetando assim o desempenho da fermentação. Entretanto a dorna com reinóculos de bactéria a cada 48 horas utilizando caldo estéril teve um pior desempenho a partir do quinto dia, indicando uma fermentação mais lenta. Para os parâmetros físicoquímicos foi constatado que houve maior produção de lactato de etila na dorna com caldo autoclavado e reinóculos da bactéria láctica, mostrando que somente a adição e os reinóculos da bactéria não garantem necessariamente uma maior presença do lactato de etila. Pode-se constatar que a relação entre a cepa de levedura e a espécie de bactéria láctica é fator importante para a presença do éster em estudo. Os resultados de acidez volátil da cachaça indicam que a adição e os reinóculos de Lactobacillus casei não interferem nesse parâmetro e mostram que a autoclavagem do caldo gera uma cachaça mais ácida. Os resultados dos testes de aceitação das cachaças produzidas indicaram que os inóculos e reinóculos de Lactobacillus casei, assim como o tratamento térmico do caldo, não interferem na percepção sensorial dos atributos analisados pelos julgadores e consumidores.

Cachaça é a bebida alcoólica destilada mais consumida no Brasil. O aumento do consumo no mercado interno e a possibilidade de ampliação da exportação exigem um produto padronizado de qualidade. Por conseguinte, a busca pela qualidade exige procedimentos técnicos em toda cadeia de suprimentos, desde a plantação da cana-deaçúcar até práticas de destilação, incluindo a qualidade do processo de fermentação, inoculação de estirpes apropriadas em concentração adequada, reciclagem controlada e condições ambientais, todos são importantes para atingir essa padronização. Este trabalho visou à caracterização molecular e bioquímica de linhagens de Saccharomyces cerevisiae da região de Salinas (MG) para fins de Identificação Geográfica. Assim, foi isolado 7680 linhagens oriundas de 14 alambiques da microrregião de Salinas (MG), das quais selecionamos 18 linhagens de S. cerevisiae com características desejáveis para a produção de cachaça conforme metodologia desenvolvida (INPI-MG Protocolo-315). As linhagens selecionadas foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). Das dezoito linhagens selecionadas, 15 linhagens foram submetidas a um experimento em escala piloto, usando dornas com capacidade de 40 L por 10 ciclos consecutivos, avaliando o desempenho fermentativo como: consumo de sólidos solúveis, teor alcoólico e acidez do vinho, bem como os compostos voláteis presentes no produto final a cachaça. Das 15 linhagens testadas foram selecionadas seis para avaliar a repetibilidade dos resultados no ano seguinte. Das seis linhagens selecionadas, duas linhagens apresentaram melhor desempenho fermentativo e foram testadas em escala de produção, usando dornas com capacidade de 800 L, para avaliar o desempenho em escala de produção e a qualidade do produto final. Posteriormente as linhagens foram analisadas quanto à produção de alcoóis superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as linhagens produzem elevada quantidade de álcool superior. Foi realizado teste de aceitação das cachaças produzidas com as linhagens selecionadas. Para a caracterização molecular das linhagens em estudo, o polimorfismo do DNA das linhagens foi analisado com as técnicas de RAPD-PCR, COX-PCR e análises de microssatélites. Nossos resultados demonstraram que a análise de microssatélites permitiu uma nítida distinção dentre as linhagens analisadas, ao contrário das técnicas de RAPD-PCR e COX-PCR. Demonstrando, assim, ser necessário o uso de diferentes técnicas combinadas na análise do polimorfismo das linhagens. A caracterização molecular mostrou um polimorfismo entre as linhagens selecionadas e claras diferenças sobre linhagens isoladas de outras regiões de Minas Gerais, sugerindo uma forte correlação entre a origem geográfica e as características genéticas de linhagens de leveduras.

Kluyveromyces lactis é uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso é considerada como modelo alternativo para estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos de leveduras não Saccharomyces. Compreender os mecanismos de captação de lactose e a regulação envolvida no transporte é um passo importante para melhores aplicações biotecnológicas destas células. O transporte de lactose, em K. lactis é mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As células foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3% w/w)) a uma concentração de 2% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 ° C. As células foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por três vezes com água fria, resuspensas em 100 mM Tris / tampão de citrato, pH 5.0 para medições de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cinética da taxa inicial de captação de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentrações de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p também foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as células foram cultivadas em lactose e divididas em duas alíquotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As células foram colhidas, lavadas e a captação inicial de lactose foi medida. A taxa de captação inicial de [D-glucose-1-14C] lactose também foi investigada em células cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presença / ausência de cicloheximida ou Higromicina B. A localização do transportador Lac12-GFP foi investigada em células crescidas em glicose e em células transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de açúcares por células de K.lactis foi analisado através de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em células cultivadas em 2% de lactose obedece a uma cinética de saturação. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 ± 0,38 mM e a velocidade máxima (Vmáx) foi 953,47 ± 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em células cultivadas em galactose e glicerol. As células cultivadas em 2% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as células crescidas em glicose foram transferidas para 2% (w/v) de lactose, o transporte exibe recuperação parcial. Esta recuperação não parece requerer a síntese de proteínas uma vez que cicloheximida e higromicina B não impediram a desrepressão parcial. Além disso, o transporte de lactose não é inativado pela glicose. A localização sub celular do transportador Lac12 é dependente da fonte de carbono e da sua concentração. O consumo de glicose e lactose é simultâneo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose é preferencial ao de galactose quando os dois açúcares estão presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 é constitutivo e que a glicose exerce um controle não muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.

Em processos fermentativos, as células de leveduras são expostas a alterações ambientais, tais como alterações nos níveis de nutrientes, temperatura, pH, concentração de etanol, concentração de O2, e outras mudanças. A capacidade de responder às condições ambientais é importante para a funcionalidade e sobrevivência das células. Na literatura, são amplamente discutidos os problemas relacionados à resposta ao estresse por ácidos orgânicos fracos produzidos durante o processo fermentativo ou aqueles utilizados como conservantes e à micro-organismos competidores. A resposta ao estresse induzido por ácidos inorgânicos é pouco estudada uma vez que este ambiente é encontrado quando se reciclam células em processos industriais e quando se utilizam leveduras como probiótico. O objetivo deste trabalho foi investigar a importância das reservas energéticas ATP, trealose e glicogênio, na resposta ao estresse ácido inorgânico em diferentes linhagens de Saccharomyces. Os resultados obtidos mostram que as linhagens de Saccharomyces cerevisiae: var. boulardii, LBCM 479 (ena1-4 ) e UFMG 905 submetidas a um estresse ácido severo (pH 2), imposto pelo ácido inorgânico HCl, são mais tolerantes a essa condição do que a S. cerevisiae W303, que apresentou maior sensibilidade. Foi observado um consumo de ATP e mobilização de trealose ao longo da exposição ao ácido em todas as linhagens. A reserva de glicogênio não pareceu ser importante para a resposta ao ácido, no período de ensaio analisado, quando a trealose ainda se encontrava presente. Os dados sugerem que um dos fatores envolvidos na resposta a este estresse, em relação à viabilidade celular, relaciona-se ao conteúdo/mobilização de reservas energéticas, especialmente, do dissacarídeo trealose. Interessantemente, a linhagem W303 mostrou aumento das reservas de trealose e uma maior capacidade de sobreviver ao estresse ácido quando exposta ao HCl antes e depois de um estresse térmico moderado em fases de crescimento exponencial e estacionária. Um aumento das reservas de glicogênio ocorreu após o estresse térmico subletal apenas na fase estacionária. Provavelmente, essa resposta envolve também mudanças na expressão gênica. A sobrevivência em mutantes nulos tps1(subunidade do complexo trealose fosfato sintase/fosfatase), nth1 e nth2 (genes das trealases neutras), ath1 (gene da trealase ácida), assim como a atividade enzimática sugerem que esses genes são importantes para a resposta ao estresse ácido inorgânico. Em conjunto, os resultados sugerem que o conteúdo e a mobilização de reservas energéticas, principalmente de trealose, parecem estar envolvidos na resposta ao estresse por ácido inorgânico. Além disso, células de W303 submetidas a um estresse de temperatura subletal respondem melhor ao estresse ácido e, esta resposta coincide com uma maior mobilização de trealose.

Etanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.

A cerveja é uma bebida alcoólica produto da fermentação do malte de cevada por leveduras que vem sendo produzida desde, aproximadamente, 6000 anos a.C. Além de gás carbônico e etanol, as leveduras produzem durante a fermentação, compostos secundários que são responsáveis pela formação do flavour e consequente qualidade sensorial da bebida. Por isso o uso de leveduras selecionadas tem sido um aspecto de grande importância na obtenção de bebidas. Na fabricação da cerveja, podem ser utilizadas leveduras do tipo ale ou lager, que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. Estas espécies podem ser classificadas tanto por testes bioquímicos quanto por seu comportamento diferencial durante a fermentação. O Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP conta com uma coleção de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas a partir de dornas de fermentação de cachaça, as quais foram selecionadas por sua alta capacidade de produção de compostos voláteis e alta resistência a diferentes tipos de estresse. O presente trabalho objetivou a caracterização bioquímica e molecular de 21 cepas da coleção LBCM e a utilização de critérios de seleção visando à aplicação destas cepas à produção de cervejas. Das 21 cepas estudadas, 11 foram capazes de fermentar maltose, apresentando velocidade específica de crescimento semelhante em meio contendo glicose. A identificação molecular das cepas através da região ITS-5.8S do rDNA confirmou que 10 cepas pertencem à espécie S. cerevisiae. Dois grupos de testes foram aplicados posteriormente sobre as 10 cepas selecionadas e 4 cepas cervejeiras comerciais. O primeiro grupo de testes incluiu critérios de seleção baseados na classificação ale e lager, no perfil de floculação e na capacidade de crescer sob baixas temperaturas. O segundo grupo, incluiu testes complementares baseados na tolerância ao etanol, na produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e 4-vinilguaiacol (4-VG), no transporte de α-glicosídeos e na síntese de micocinas. Os resultados mostraram que três das 10 cepas estudadas foram capazes de fermentar melobiose e secretar melobiase, perfil característico de cepas tipo lager, embora todas as cepas tenham crescido a 37°C. Além disso, 9 foram capazes de crescer a 20°C e 7 a 15°C. Quanto ao perfil de floculação, 9 cepas apresentaram percentuais de floculação maior que 36% e responderam com um fenótipo New-Flo. A presença dos genes FLO1, FLO5 e FLO11 foi verificada por PCR e quantificada por qPCR, sendo relevante a presença dos genes FLO5 e FLO11 na maioria das cepas. Em geral, as cepas mais floculantes foram também as que apresentaram maior hidrofobicidade na sua superfície celular. Quanto aos testes complementares, as cepas apresentaram resistência a altas concentrações de etanol (20% (v/v)), baixa ou nenhuma produção de H2S (off flavour) e síntese de 4-VG em concentrações semelhantes às apresentadas pelas cepas comerciais tipo ale. Considerando a importância do consumo total dos açúcares presentes no mosto, em especial a maltotriose, o transporte de α-glicosídeos foi avaliado. As cepas apresentaram um transporte de α-glicosídeos semelhante aos valores revelados pelas cepas cervejeiras comerciais. Finalmente, as cepas foram submetidas a testes de produção e resistência a micocinas, considerando o uso de fermentações consorciadas. Os resultados revelaram que todas as cepas experimentais não são sensíveis, tampouco prejudiciais a outras espécies. Com base nos resultados dos testes complementares, foram selecionadas as cepas experimentais LBCM 45 e 78 para a produção de cervejas german pilsner e weissbier, respectivamente. As cervejas produzidas foram submetidas a análises físico-químicas, cujos resultados mostraram que as cepas em estudo, LBCM 45 e 78 apresentaram comportamento semelhante às cepas cervejeiras comerciais W-34/70 e WB-06. Portanto, os resultados do presente trabalho contribuíram para uma melhor caracterização da grande diversidade de linhagens de S. cerevisiae isoladas da produção de cachaça, visando sua potencial utilização na produção de outras bebidas alcoólicas fermentadas, tais como as cervejas, além da sua possível utilização em fermentações consorciadas.