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Cachaça é a bebida destilada mais consumida no Brasil, e a terceira mais consumida no mundo. O Brasil exporta este produto para 45 países, porém estas vendas não atingem 1% da produção nacional. Para incrementar a exportação é necessário que se atinja um novo patamar de qualidade. Tal qualidade pode ser alcançada pela utilização de Lactato de etíla leveduras selecionadas, que permitem a obtenção de estabilidade físico-química e sensorial, além de incremento do “flavour” devido à maior produção de compostos voláteis, especialmente álcoois superiores e ésteres. Um importante éster, o lactato de etila, é descrito como tendo caráter frutado e habilidade de mascarar o sabor vegetal residual da cachaça. Ele é formado pela esterificação do etanol com ácido lático, produzido por bactérias láticas (LABs), que por sua vez são consideradas contaminantes do processo. O objetivo deste trabalho é investigar se é possível a utilização de bactérias láticas em fermentação mista, para a produção de cachaça de alto padrão de qualidade, devido ao incremento nos teores do éster lactato de etila. Este trabalho utiliza uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae selecionada, a LBCM606, em associação a cada uma das quatro cepas bacterianas descritas entre os contaminantes mais comuns da fermentação da cachaça: Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum, além da cepa isolada de Yakult® Lactobacillus casei Shirota, utilizada como controle industrial, e duas cepas isoladas de dorna, bLBCM680-2 e bLBCM680-3. As fermentações mistas foram comparadas à fermentação tradicional. Alíquotas da fermentação foram retiradas nos tempos de 0, 2, 4, 6, 8, 24 e 48h e analisadas quanto ao pH e consumo de sacarose, e nos tempos 0, 24 e 48h quanto à população de células. Tais análises não forneceram evidências de que bactérias até a concentração de 106 UFC/ml possam prejudicar o processo produtivo da cachaça devido ao consumo de açúcares e queda da viabilidade de leveduras provocada por acidificação do meio. A dosagem de lactato de etila foi realizada por CG-MS nos tempos de 8, 24 e 48h de fermentação, e revelam um desempenho superior das cepas isoladas de dorna e, principalmente, do controle industrial, L. casei. Estas três cepas testadas sob a condição de reciclo de células, mantém a viabilidade de células bacterianas apenas ao longo dos três primeiros ciclos, sendo que no décimo ciclo, a contagem de células viáveis é menor que 0,5% da contagem do primeiro ciclo. A cepa bLBCM680-2 por possuir uma produção de lactato de etila mais estável ao longo dos ciclos, é a mais promissora para a utilização em dornas de produção de cachaça.

A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma bomba de prótons que possui um papel importante na fisiologia deste microrganismo, uma vez que ativada é capaz de criar um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, está de alguma maneira ligada ao metabolismo de cálcio. No entanto, a identidade da(s) proteína quinase(s) que leva à ativação da enzima ainda não foi identificada. Neste trabalho, nós mostramos os resultados de uma triagem com as cepas de levedura que apresentam deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases existentes em Saccharomyces cerevisiae. Para isso, foi avaliada a variação do pH extracelular durante o crescimento celular, com adição de glicose, de leveduras apresentando deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases conhecidas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços em YPD 2%, e cada cultura foi avaliada com o indicador ácido-base púrpura de bromocresol. Nossos resultados demonstraram que das 95 amostras analisadas, 53 foram incapazes de promover a acidificação durante o crescimento celular. Quando a ativação induzida por glicose foi medida por meio da determinação da acidificação extracelular, apenas 20 mutantes apresentaram uma clara redução na taxa de acidificação, quando comparados à linhagem selvagem. Para eliminar as quinases que poderiam estar indiretamente envolvidas na regulação da ATPase, a sinalização de cálcio foi medida e 14 mutantes apresentaram níveis de cálcio normais durante a sinalização induzida por glicose. Posteriormente, nós determinamos as propriedades cinéticas da enzima, em membranas plasmáticas purificadas, de mutantes com deleção em genes que codificam para 7 das 14 proteínas selecionadas como potenciais candidatas ao mecanismo de fosforilação da H+-ATPase, incluindo a cepa selvagem correspondente. No entanto, essa abordagem não permitiu esclarecer completamente a(s) identidade(s) da(s) proteína(s) quinase(s) que leva(m) à ativação da H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.

O bombeamento de prótons é um processo executado pela H+-ATPase de membrana plasmática Pma1p e é importante em Saccharomyces cerevisiae pois permite a captação de nutrientes através da criação de gradiente eletroquímico. Em presença de glicose esta enzima é ativada. Estudos preliminares mostram uma forte relação entre a presença de IP3, a liberação de cálcio vacuolar e ativação de Pma1p. Para a elucidação da via de liberação de cálcio faz-se necessária a identificação de proteínas receptoras de IP3 e suas relações que culminam neste processo. Com este objetivo nosso trabalho adotou duas estratégias independentes: a utilização de ensaio de afinidade seguida de tentativa de identificação por espectrometria de massas; e utilização de bancos de dados e recursos de bioinformática contígua a avaliações bioquímicas para uma identificação indireta através das interações descritas para Yvc1p, proteína responsável pela saída de cálcio. Na primeira estratégia, verificamos que os prováveis receptores de IP3 apresentam peso molecular entre 66 e 97 kDa, porém ainda não obtivemos a identificação por espectrometria de massas; na segunda estratégia, porém, chegamos a um grupo de seis proteínas (Yvc1p, Alg6p, Nmd2p, Mdm10p, Sse2p e Swc3p ) que estão relacionadas a liberação do cálcio vacuolar e que apresentam o peso molecular entre 66 e 97 kDa.

No Brasil, a cachaça é a mais popular bebida destilada produzida pela destilação de caldo de cana fermentado. A produção nacional é estimada em torno de 1,3 bilhões de litros por ano, dos quais menos de 1% é exportado. Como conseqüência desta pequena exportação, grandes esforços tem sido realizados para aumentar a qualidade deste produto e aumentar a participação deste produto no mercado internacional. Usualmente o processo de fermentação do caldo de cana é conduzido por uma sucessão de cepas de leveduras, sendo que a espécie de levedura predominante é a Saccharomyces cerevisiae. Na cachaça e em outras bebidas como o vinho, tem sido incorporado o uso de cepas selecionadas no processo fermentativo para melhorar as características das bebidas e gerar um produto de melhor qualidade. Neste trabalho, utilizamos quatro cepas oriundas de diferentes localidades geográficas, porém selecionadas e isoladas pelo mesmo procedimento conforme metodologia desenvolvida em nosso laboratório (INPI-MG Protocolo-315) que seleciona leveduras com características desejáveis para a produção de cachaça. Além destas cepas outras duas cepas previamente identificadas como resistente e sensível a cerulenina e TFL foram utilizadas nos experimentos. Neste trabalho, as cepas LBCM 600, LBCM 601, LBCM 613 e LBCM 632, selecionadas por tal metodologia foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). O polimorfismo do DNA das cepas foi analisado com as técnicas de RAPD-PCR, COX-PCR e análises de microssatélites. Nossos resultados demonstraram que a análise de microssatélites permitiu uma nítida distinção dentre todas as cepas analisadas, ao contrário das técnicas de RAPD-PCR e COX-PCR. Isto demonstrou ser necessário o uso de diferentes técnicas combinadas na análise do polimorfismo das cepas. Posteriormente as cepas foram analisadas quanto à produção de alcoóis superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as cepas produzem elevada quantidade de álcool isoamílico, octanoato e decanoato de etila. Por fim os genes BAP2, BAT1, BAT2, ATF2, ADH1 e EEB1 foram analisados em suas expressões por qRT-PCR. Ao contrário do esperado, nenhuma correlação direta pôde ser estabelecida entre o nível de expressão destes genes e a produção de compostos aromáticos. Os resultados demonstram que a metodologia de seleção desenvolvida precisa ser aperfeiçoada, sobretudo no que diz respeito à utilização de outras técnicas que possibilitem a identificação de características indicadoras por exemplo de uma maior capacidade de produção de compostos aromatizantes.

A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma enzima muito importante, pois pelo bombeamento de prótons para fora da célula, ela cria um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, é dependente do metabolismo de cálcio e que nesta via, o sensor Snf3p, parece atuar de forma paralela a Gpa2p, e que sua cauda C-terminal é aparentemente responsável por este papel. Neste trabalho, nós observamos que em baixas concentrações de cálcio externo, o sinal de cálcio, e consequentemente a ativação induzida por glicose, da H+- ATPase de membrana plasmática, é independente da atividade de proteínas responsáveis pela captação de cálcio em S. cerevisiae. Nesta condição, as células parecem ser capazes de detectar as baixas concentrações de cálcio externo e de alguma forma controlar a atividade da Ca2+- ATPase vacuolar, Pmc1p. Nós apresentamos dados que sugerem que Yvc1p, um canal de cálcio de membrana vacuolar está envolvido no sinal de cálcio induzido por glicose em células de levedura. Além disso, trabalhando com a droga 2-aminoetoxidifenil borato (2-APB), um modulador de receptores de IP3 em células de mamíferos, fomos capazes de demonstrar que provavelmente o Yvc1p funcione como um receptor de IP3 ou pelo menos responda a um componente, ainda desconhecido, sensível ao mesmo, no sinal de cálcio induzido por açúcar. Nossos resultados também sugerem que Snf3p deve regular negativamente a atividade da Ca2+- ATPase, Pmc1p, inibindo o sequestro de cálcio citosólico. Investigando os braços paralelos que regulam nossa via de estudo, observamos no duplo mutante snf3Δplc1Δ, surpreendentemente, uma reversão dos fenótipos observados nos mutantes únicos. Este comportamento pode ser explicado pelo fato de que neste mesmo duplo mutante há uma ausência de acúmulo de cálcio e então as condições de concentração e localização deste íon sejam favoráveis a uma ativação normal da H+-ATPase . Finalmente, nós demonstramos que a proteína quinase C parece estar envolvida no sinal de cálcio induzido por açúcar em células de levedura. Muito provavelmente ela participe do controle da H+-ATPase de membrana plasmática pela regulação dos níveis de cálcio e não pela fosforilação direta da enzima.

A levedura Saccharomyces cerevisiae possui uma via MAP quinase de transdução de sinais composta por Pkc1p, Bck1p, Mkk1p e Mkk2p, e Mpk1p. Já foi descrito que esta via está envolvida no controle da integridade da parede celular, na resposta ao estresse osmótico, no crescimento de pseudo-hifas e no controle do metabolismo de carbono. Neste trabalho investigamos a participação de Pkc1p no controle da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono. Para isto, fizemos uma analise da expressão gênica global através de microarranjos de DNA comparando a resposta global sob condições de repressão e desrepressão metabólica no mutante a pkc1∆ e na cepa selvagem correspondente W303. Os resultados obtidos indicaram uma diferença significativa na expressão global dos genes nas duas cepas analisadas. Vinte e oito genes envolvidos no metabolismo de carbono foram selecionados para validação por RT-PCR e os resultados confirmaram que sete genes foram mais expressos na cepa W303 quando comparada com a cepa e quatro genes foram mais expressos na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem. Análises “In silico” apontaram três fatores de transcrição Sok2p, Crz1p and Gcr1p, que podem estar envolvidos no controle da expressão gênica por Pkc1p. Experimentos utilizando plasmídeos contendo o gene da β- galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram que a expressão destes genes se apresentava diminuída na cepa pkc1∆ para o gene HXT1, aumentada para o gene CYC1 e igual para o gene SUC2 quando comparada com a cepa selvagem W303. A atividade de Invertase apresenta-se significativamente diminuída na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem W303. Nossos resultados confirmam a participação da proteína Pkc1p na regulação da expressão gênica durante o processo de desrepressão metabólica.

Com o objetivo de caracterizar molecularmente a cepa Saccharomyces cerevisiae LBCM 427, selecionada a partir de dornas de fermentação de cachaça, utilizaram-se várias metodologias de análise de polimorfismo de DNA para permitir a discriminação entre esta e as cepas presentes no local de origem. Os resultados demonstraram que RAPD-PCR, mtDNA, e PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não foram suficientes para uma boa diferenciação entre a cepa LBCM 427 e cepas isoladas na mesma dorna de fermentação. Por outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação com base no perfil cromossomal permitiu uma nítida distinção entre o grupo de cepas analisadas. Estes resultados demonstram que o uso de cepas iniciadoras requer um acompanhamento com o uso combinado de métodos bioquímicos e moleculares. A cepa parenteral LBCM 427, foi segregada e as tétrades analisadas quanto a estabilidade fisiológica e bioquímica em passagens sucessivas. Avaliaram-se os seguintes parâmetros floculação, não produção de H2S, resistência a 5,5´,5´´-trifluoro-DLleucina (TFL) e cerulenina, crescimento em diferentes condições de pressão osmótica e de temperatura. Os resultados demonstraram que nenhuma cepa segregante reuniu todas as características da cepa parental. Diante disto, foi selecionada uma cepa segregante que atendia ao critério de resistência a TFL e cerulenina para analisar o comportamento em uma fermentação em caldo de cana e possíveis mutações no gene LEU4 que transcreve para a - isopropilmalato sintase. Esta segregante não foi afetada na presença de altas concentrações de L-leucina (20 mM) e, apresentou mutações no gene LEU4 ainda não descritas pela literatura. A cepa LBCM 427 e segregante foram avaliadas quanto à produção de cachaça em escala piloto. Os parâmetros analisados foram: o perfil químico da bebida produzida e a adaptação das cepas em condições similares às encontradas na fabricação artesanal da cachaça. Por cromatografia gasosa, quantificaram-se os compostos voláteis sendo estes o acetaldeído, acetato de etila, metanol, n-propanol, isobutanol, álcool isoamílico, e furfural. Verificou-se que as cepas LBCM 427 e segregante produzem elevados teores de álcool isoamílico e álcool isobutílico quando comparadas a uma cepa Saccharomyces cerevisiae comercial utilizada como controle. Outra cepa utilizada como controle do processo, a cepa nativa LBCM 422, sensível a ambos compostos, produziu quantidades semelhantes de álcool isoamílico quando comparada às cepas LBCM 427 e segregante, resistentes a TFL e cerulenina. Os resultados apresentados oferecem uma importante contribuição para o desenvolvimento de novas estratégias de seleção de cepas selvagem com características específicas, levando a produção da cachaça com maior produção de compostos flavorizantes.

A H+-ATPase de membrana citoplasmática da levedura Saccharomyces cerevisiae é uma bomba de prótons que possui um papel essencial na fisiologia da levedura. A atividade desta enzima é regulada tanto a nível transcricional quanto a nível pós-transcricional e uma importante característica é o fato desta enzima ser ativada por glicose, baixo pH e por agentes despolarizantes. A via de ativação da H+-ATPase por agentes despolarizantes ainda não é conhecida. Neste trabalho sugerimos uma via de transdução de sinal semelhante a do fosfatidil inositol como parte do mecanismo de ativação ATPásica pelo Cianeto carbonil mclorofenilhidrazona. Nesta via esta droga ativaria a enzima fosfolipase C que hidrolisaria o fosfatidilinositol-bifosfato em dois componentes, diacilglicerol e inositol tri-fosfato. O inositol trifosfato gerado estaria desencadeando a mobilização de cálcio extracelular e de estoques intracelulares. O aumento dos níveis de cálcio livre citosólico, juntamente com a formação de diacilglicerol, poderia estar levando a ativação da proteína quinase C, que uma vez ativa, estaria fosforilando a H+-ATPase em dois resíduos de aminoácidos essenciais para a mudança conformacional da enzima, tornando-a ativa.

A proteína quinase C (Pkc1p) de Saccharomyces cerevisiae, codificada pelo gene PKC1, participa de uma cascata de MAPKinase denominada via de integridade celular ou via PKC-MAPKinase cuja principal função é a biosíntese da parede celular. Além disso, diversos processos celulares tem sido descritos como tendo a participação de Pkc1 p: a síntese de ribossomos, a realocação de fatores transcricionais como Mig1 p, a regulação da atividade de N-glicosilação, a fusão de membranas celulares, o crescimento polarizado e o controle da polarização do citoesqueleto de actina. O mutante pkc1Δ não é capaz de crescer em meio de cultura contendo glicerol como única fonte de carbono. Buscando elucidar as bases moleculares que explicam tal fenótipo, demonstramos nesse trabalho que pkc1Δ apresenta baixa atividade da enzima glicerol quinase quando comparada à cepa selvagem em virtude da menor expressão do gene GUT1 nesse mutante. Similarmente ao observado para o mutante pkc1Δ, o mutante gup1Δ apresenta fraco crescimento em fontes de carbono alternativas como etanol, glicerol e rafinose, e sensibilidade aos estresses ácido e oxidativo. A fraca performance em rafinose não está associada a uma baixa atividade da enzima invertase, enquanto a sensibilidade ao estresse ácido não deve estar relacionada à baixa atividade da enzima H+-ATPase. Como Gup1 p tem atividade de remodelase da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e considerando que essa atividade é importante para produção de proteínas GPI-ancoradas ativas, os fenótipos observados para o mutante gup1Δ podem estar relacionados a falta da atividade de remodelase nesse mutante. Embora os fenótipos dos mutantes pkc1Δ e gup1Δ sejam similares, o mutante pkc1Δ apresenta níveis de expressão do gene GUP1 comparáveis aos encontrados para a cepa selvagem.

Cachaça é a mais popular bebida destilada produzida no Brasil. Em Minas Gerais a atividade se encontra em expansão, com uma produção anual de cerca de 230 milhões de litros, sendo uma grande atividade econômica com boas perspectivas para o mercado externo. Usualmente o processo de fermentação do caldo de cana é conduzido por uma sucessão de cepas de leveduras, sendo que a espécie de levedura predominante é a Saccharomyces cerevisiae. O aroma e o sabor são características que influenciam, identificam e oferecem qualidade às bebidas fermentadas. Na cachaça, e em outras bebidas como o vinho, tem sido incorporado o uso de cepas selecionadas no processo fermentativo para melhorar as características das bebidas e gerar um produto de melhor qualidade. Neste trabalho, isolamos cepas de S. cerevisiae de diferentes regiões do estado de Minas Gerais, usando a nova metodologia (INPI-MG Protocolo-315) que seleciona leveduras com características desejáveis para a produção de cachaça. Assim, as cepas foram selecionadas seguindo critérios relevantes para a produção da bebida, como: não produção de H 2 S, tolerância a etanol e a temperaturas elevadas, capacidade fermentativa, floculação e produção de micocinas. As leveduras foram também expostas a drogas como TFL e cerulenina para identificar aquelas maiores produtoras de álcoois superiores e ésteres. As cepas selecionadas foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). Nos últimos anos, várias metodologias baseadas na análise do polimorfismo do DNA têm sido utilizadas para permitir a discriminação entre cepas inoculadas de cepas remanescentes presentes na flora indígena envolvidas no processo fermentativo. Em nossos resultados demonstramos que o RAPD-PCR utilizando primers baseados no sítio de splicing de introns e PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não são suficientes para permitir uma boa diferenciação entre as cepas selecionadas, porém estas técnicas permitiram a distinção entre diferentes espécies de leveduras pertencentes ao grupo Saccharomyces sensu stricto. Por outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação das cepas com base no perfil cromossomal, permitiu uma nítida distinção entre todas as cepas analisadas. Apesar do grande polimorfismo molecular encontrado não observamos correlação entre diversidade genética e localização geográfica. Posteriormente as cepas foram analisadas quanto a produção de álcoois superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as cepas produzem elevada quantidade de álcool isoamílico e caproato de etila. Os resultados demonstram que a metodologia utilizada é apropriada para a seleção de cepas com características adequadas para serem utilizadas na produção de cachaça de alambique. E que a utilização de cepas selecionadas como fermento iniciador requer o uso combinado de métodos bioquímicos e moleculares que possibilitem caracterizar e analisar a dinâmica das cepas selecionadas durante todo o processo fermentativo .

Em leveduras, a proteína quinase C participa da regulação da via bioquímica responsável pela transcrição de uma subunidade da enzima glucano sintase, a qual está envolvida na síntese da parede celular. A via PKC MAP quinase consiste das enzimas Bck1, Mkk1/2 e Mpk1 que são ativadas por fosforilação. Recentemente, nós descobrimos que o mutante pkc1 D, contrariamente aos demais mutantes da cascata Map quinase, exibe dois principais defeitos no controle do metabolismo de carbono. A cepa pkc1 D apresenta um atraso na iniciação da fermentação e um defeito na desrepressão após a exaustão de glicose do meio. Estes fatos são consistentes com a hipótese de que há uma bifurcação depois de Pkc1 p, sugerindo que esta proteína quinase possui varias funções importantes em levedura. Baseados na característica que o mutante pkc1D é incapaz de crescer em glicerol, nós isolamos um novo mutante da cepa pkc1 D que apresenta um crescimento normal em glicerol. O novo mutante (LBFM335) foi transformado com uma biblioteca genômica de levedura e nós isolamos dois transformantes (LBFM342 e LBFM342) que recuperaram o fenótipo original do mutante pkc1 D (incapacidade de crescer em glicerol). Neste trabalho, nós caracterizamos um novo mutante (LBFM 335) que alivia o fenótipo repressivo de pkc1 D em Sccharomyces cerevisiae . Além disso, nós isolamos dois supressores extragênicos desta mutação, que foram identificados como a exportina nuclear Msn5 e a histona deacetilase Hos2.