Produções

This work was performed to verify the potential of yeast strains isolated from cachaça distilleries for two specific biotechnological applications: beer and bioethanol production. In the beer production, the strains were tested for characteristics required in brewery practices, such as: capacity to ferment maltose and maltotriose, ability to grow at lowest temperatures, low H₂S production, and flocculation profile. Among the strains tested, two of them showed appropriate characteristics to produce two different beer styles: lager and ale. Moreover, both strains were tested for cachaça production and the results confirmed the capacity of these strains to improve the quality of cachaça. In the bioethanol production, the fermentation process was performed similarly to that used by bioethanol industries: recycling of yeast biomass in the fermentative process with sulfuric acid washings (pH 2.0). The production of ethanol, glycerol, organic acids, dry cell weight, carbohydrate consumption, and cellular viability were analyzed. One strain presented fermentative parameters similar to PE2, industrial/commercial strain, with equivalent ethanol yields and cellular viability during all fermentative cycles. This work demonstrates that cachaça distilleries seem to be an interesting environment to select new yeast strains to be used in biotechnology applications as beer and bioethanol production.

The aim was to investigate a possible role of the ACTN3 R577X polymorphism in a Brazilian football player’s career progression. 2 questions were formulated: 1. Does ACTN3 polymorphism affect the probability of an individual being a professional football player? 2. Does this polymorphism affect the progression of the athlete throughout his career? The study included 353 players from first division Brazilian football clubs in the following categories: under-14 (U-14), U-15, U-17, U-20, and professional (PRO). The control group (CON) was composed of 100 healthy non-athletes. The chi-squared test was used to assess differences between the allele and genotype frequencies. Comparing football categories, the XX genotype was less frequent among professional players than in the U-20 (p<0.05) or the U-15 category (p<0.05). The RX genotype also presented more frequently in the PRO category than the U-14 category (p<0.05). Moreover, a trend towards a higher frequency of the RX genotype and a lower frequency of the XX genotype was observed in the professional category compared to U-20. These results suggest that the genotype in the ACTN3 polymorphism affects the probability of a football player progressing throughout his career and becoming professional, meaning that playing football selects against the ACTN3 XX genotype.

Genetic diversity and population studies are essential for conservation and wildlife management programs. However, monitoring requires the analysis of multiple loci from many samples. These processes can be laborious and expensive. The choice of microsatellites and PCR calibration for genotyping are particularly daunting. Here we optimized a low-cost genotyping method using multiple microsatellite loci for simultaneous genotyping of up to 384 samples using next-generation sequencing (NGS). We designed primers with adapters to the combinatorial barcoding amplicon library and sequenced samples by MiSeq. Next, we adapted a bioinformatics pipeline for genotyping microsatellites based on read-length and sequence content. Using primer pairs for eight microsatellite loci from the fish Prochilodus costatus, we amplified, sequenced, and analyzed the DNA of 96, 288, or 384 individuals for allele detection. The most cost-effective methodology was a pseudo-multiplex reaction using a low-throughput kit of 1 M reads (Nano) for 384 DNA samples. We observed an average of 325 reads per individual per locus when genotyping eight loci. Assuming a minimum requirement of 10 reads per loci, two to four times more loci could be tested in each run, depending on the quality of the PCR reaction of each locus. In conclusion, we present a novel method for microsatellite genotyping using Illumina combinatorial barcoding that dispenses exhaustive PCR calibrations, since non-specific amplicons can be eliminated by bioinformatics analyses. This methodology rapidly provides genotyping data and is therefore a promising development for large-scale conservation-genetics studies.

Cryptic relatedness is a confounding factor in genetic diversity and genetic association studies. Development of strategies to reduce cryptic relatedness in a sample is a crucial step for downstream genetic analyses. This study uses a node selection algorithm, based on network degrees of centrality, to evaluate its applicability and impact on evaluation of genetic diversity and population stratification. 1,036 Guzerá (Bos indicus) females were genotyped using Illumina Bovine SNP50 v2 BeadChip. Four strategies were compared. The first and second strategies consist on a iterative exclusion of most related individuals based on PLINK kinship coefficient (φij) and VanRaden's φij, respectively. The third and fourth strategies were based on a node selection algorithm. The fourth strategy, Network G matrix, preserved the larger number of individuals with a better diversity and representation from the initial sample. Determining the most probable number of populations was directly affected by the kinship metric. Network G matrix was the better strategy for reducing relatedness due to producing a larger sample, with more distant individuals, a more similar distribution when compared with the full data set in the MDS plots and keeping a better representation of the population structure. Resampling strategies using VanRaden's φij as a relationship metric was better to infer the relationships among individuals. Moreover, the resampling strategies directly impact the genomic inflation values in genomewide association studies. The use of the node selection algorithm also implies better selection of the most central individuals to be removed, providing a more representative sample.

The pattern of glucose repression in most Kluyveromyces marxianus strains does not correlate with fermentative behaviour; however, glucose repression and fermentative metabolism appear to be linked to the kinetics of sugar uptake. In this work, we show that lactose transport in K. marxianus CCT 7735 by lactose-grown cells is mediated by a low-affinity H⁺-sugar symporter. This system is glucose repressed and able to transport galactose with low affinity. We also observed the activity of a distinct lactose transporter in response to raffinose. Regarding glucose uptake, specificities of at least three low-affinity systems rely on the carbon source available in a given growth medium. Interestingly, it was observed only one high-affinity system is able to transport both glucose and galactose. We also showed that K. marxianus CCT 7735 regulates the expression of sugar transport systems in response to glucose availability.

A cerveja é uma das bebidas alcoólicas mais consumidas no mundo, fazendo parte da cultura da maioria das civilizações. A produção de cerveja é resultado do metabolismo das leveduras que, a partir dos açúcares presentes no mosto, formam dois produtos principais: etanol e dióxido de carbono – processo denominado fermentação. Além disso, há, geralmente, a formação de pequenas quantidades de outros componentes, chamados compostos secundários. A qualidade sensorial de bebidas fermentadas está intimamente relacionada com as concentrações equilibradas dos seus compostos secundários. Além das leveduras, bactérias lácticas também podem ser utilizadas na fermentação de bebidas, contribuindo para a qualidade sensorial do produto final. A influência dessa fermentação consorciada foi estudada na produção de uísque, vinho e cachaça, sendo seu maior benefício a produção do éster lactato de etila. Este éster, formado pela esterificação do etanol com o ácido láctico, contribui para o aroma e sabor da bebida devido ao seu caráter frutado. Os estudos já realizados com fermentação consorciada na produção de cerveja estão relacionados às cervejas Lambic, cuja fermentação acontece espontaneamente por microrganismos presentes no ambiente produtivo. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma cerveja a partir do inóculo controlado de Lactobacillus brevis em consórcio com a levedura Saccharomyces cerevisiae, a fim de avaliar a contribuição das bactérias lácticas sobre as características sensoriais do produto final. As quatro cepas de L. brevis (LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720) tiveram sua capacidade de crescimento avaliado em diferentes temperaturas (15°C e 20°C), sendo que a 20°C o desempenho observado foi mais próximo à temperatura controle (30°C). As fermentações entre os quatro isolados de L. brevis em consórcio com a levedura S. cerevisiae LBCM1078 foram realizadas, primeiramente, em escala laboratorial, em meio sintético YP maltose 2%, onde foi possível avaliar o desempenho fermentativo dos microrganismos, bem como a produção de ácido láctico, ácido acético e lactato de etila. Também foi avaliado o desempenho fermentativo desses consórcios em extrato de malte 16%, comparando-se dois momentos do inóculo das bactérias lácticas: início ou final da fermentação alcoólica. As cepas LBCM718 e LBCM720, quando inoculadas no início da fermentação alcoólica, se destacaram quanto à produção de lactato de etila, sendo, portanto, selecionadas para a etapa de produção de cerveja em maior escala. Foram produzidas três cervejas utilizando consórcio entre LBCM1078 e LBCM718, consórcio entre LBCM1078 e LBCM720 e fermentação controle, somente com a levedura LBCM1078. Foram avaliados os seguintes parâmetros do produto final: álcoois superiores, ésteres de acetato, ésteres de ácido graxo de cadeia média, etanol, pH e lactato de etila. As cervejas produzidas em consórcio com bactérias apresentaram maiores concentrações de lactato de etila e isobutanol e menores concentrações de acetaldeído. Além disso, não houve prejuízo quanto ao conteúdo de etanol, pelo inóculo de bactérias. Os resultados apresentados nesse trabalho sugerem que as bactérias lácticas podem ser uma nova alternativa para a produção de cerveja com alto padrão de qualidade, uma vez que tais microrganismos são conhecidos como seguros e podem contribuir para o aroma do produto.

A H+-ATPase de membrana plasmática, codificada pelo gene PMA1, é responsável pela formação de um gradiente eletroquímico de prótons que possibilita o controle do pH intracelular e a captação de nutrientes pela célula. A Pma1p é ativada na presença de glicose e várias proteínas estão envolvidas nesse processo, modulando de forma direta ou indireta, a atividade desta enzima. Estudos prévios, realizados em diferentes background de S. cerevisiae, correlacionaram vários genes envolvidos na atividade da Pma1p, mas ainda não foi elucidado o papel de cada um deles nesta via de ativação, bem como a relação deles em cada background estudado. No presente trabalho foi realizada a construção de múltiplos mutantes para os genes PMC1, SNF3 e ARG82 em dois diferentes background de S. cerevisiae (BY4741 e PJ69) a fim de ampliar o conhecimento dos mecanismos envolvidos na via de sinalização da ativação da H+-ATPase mediada por glicose. Para isso, foram realizados procedimentos de acidificação celular do meio, determinação da disponibilidade de cálcio intracelular e avaliação da sensibilidade ao antibiótico higromicina B e ao alumínio. Os resultados do presente trabalho confirmaram a importância dos genes ARG82, PMC1 e SNF3 na regulação da atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, em S. cerevisiae. Foram verificadas variações na disponibilidade de cálcio citosólico e na atividade de Pma1p entre os mutantes construídos. Aparentemente, a proteína Arg82p, dentre as três proteínas estudadas neste trabalho, possui um papel mais importante na ativação da enzima Pma1p, seja na: (i) modulação do cálcio intracelular, (ii) na acidificação do meio, (iii) na sensibilidade à higromicina e ao alumínio, e (iv) na capacidade fermentativa das células. Contudo, apesar da importância do cálcio como regulador intracelular na atividade de Pma1p, não foi verificada uma relação direta entre a concentração de cálcio citosólico e a atividade de Pma1p sugerindo que outros fatores possam estar envolvidos. Ademais, os diferentes resultados encontrados, nos diferentes backgrounds, demonstraram que o efeito das mutações poderia ser dependente da linhagem analisada.

A H+-ATPase de membrana citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae mantem o gradiente eletroquímico necessário para o transporte de íons, de nutrientes essenciais e pelo controle do pH interno. A ativação da H+-ATPase da membrana citoplasmática em S. cerevisiae induzida pela glicose é dependente de cálcio e o metabolismo do fosfatidilinositol parece estar envolvida neste processo de ativação da enzima. A proteína Arg82 p é uma inositol quinase que tem como uma das suas funções fosforilar o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) em inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (IP4) e inositol 1,3,4,5,6-pentafosfato (IP5) considerados importantes mensageiros na regulação da homeostase de Ca2+ citosólico. O mutante arg82 da linhagem de S. cerevisiae PJ69 apresenta uma atividade da H+-ATPase superior a linhagem selvagem, indicando uma relação da ausência dessa proteína com o aumento nas concentrações de IP3 e de cálcio citosólico com subsequente ativação da H+-ATPase. Curiosamente, esse efeito não é observado com o mesmo mutante obtido para a linhagem BY4742. Para estudar essa aparente contradição foram realizados cruzamentos o mutante arg82 do background PJ69 (apresentando maior ativação da Pma1 p induzida por glicose) e a estirpe selvagem do background BY4742 (com menor ativação da Pma1), com posterior seleção de segregantes que possuem os fenótipos similares ao da linhagem parental superior (arg82 do background PJ69). Após cruzamento dessas linhagens, 600 segregantes F1 foram testados quanto à suscetibilidade ao antibiótico higromicina e ao cloreto de lítio. Aproximadamente 34 segregantes que apresentaram comportamento similar ao parental superior foram selecionados para análise da acidificação induzida por glicose para confirmação da maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose. Dentre esses segregantes, vinte com fenótipo superior podem ser utilizados para o mapeamento de QTLs relacionados à maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose na linhagem S. cerevisiae PJ694a.

Na fabricação de cervejas estilos Ale ou Lager, são utilizadas leveduras pertencentes às espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. As cepas do estilo Lager fermentam em baixas temperaturas, produzem menores concentrações de compostos responsáveis por aroma e são consideradas de baixa fermentação, por flocularem. As cepas do estilo Ale fermentam a temperaturas mais elevadas, produzem altas concentrações de alcoóis superiores e ésteres e são consideradas de alta fermentação. O objetivo deste trabalho foi estudar a capacidade de esporulação, a característica reprodutiva, assim como a aplicação de técnicas de cruzamentos entre leveduras isoladas de dornas de fermentação da cachaça para a obtenção de novas estirpes com potencial para produção de cerveja. Das 128 cepas de leveduras caracterizadas quanto à freqüência e eficiência da esporulação, 121 leveduras (95%) apresentaram esporulação acima de 50%, sendo que quatorze não foram capazes de esporular. Vinte e quatro cepas apresentaram viabilidade de esporos acima de 91% e sete cepas não apresentaram viabilidade dos esporos. Apenas, três cepas de leveduras foram classificadas como heterotálicas: LBCM1073, LBCM1078 e LBCM1115. A partir dos resultados apresentados e de outros resultados do nosso grupo de pesquisa, como a caracterização da produção de compostos responsáveis pelo aroma, capacidade de fermentação de açúcares e de floculação, duas cepas foram selecionadas para cruzamentos. A cepa LBCM1078 apresenta capacidade de fermentação de maltose e alta produção de compostos responsáveis por aroma, enquanto a cepa LBCM1092 apresenta uma floculação constitutiva. A partir das duas técnicas de cruzamento desenvolvidas, entre células haplóides e entre células diplóides, 21 e 33 híbridos foram obtidos, respectivamente. Os híbridos foram avaliados quanto à capacidade de fermentação de maltose e a capacidade de floculação, sendo selecionadas três novas cepas para futuros experimentos de fermentação em condições similares à produção de cerveja.

Existem micro-organismos capazes de utilizar o glicerol como fonte de carbono e energia, sendo assim, bastante atrativos como bioconversores do glicerol bruto gerado a partir da produção de biodiesel. Em Saccharomyces cerevisiaea via de metabolização do glicerol é bem definida, em que um sistema simporte de prótons, codificado pelo gene STL1, é preferencialmente utilizado na captação do glicerol quando fontes fermentáveis de carbono não estão presentes. O presente trabalho objetivou identificar o gene STL1 que codifica um provável transportador de glicerol em Wickerhamomyces anomalus LBCM105, cujo o genoma ainda não se encontra disponível em banco de dados. O gene identificado apresentou 1443 pb e 480 aminoácidos. A análise in sílico comparativa da região promotora identificou fatores de transcrição putativos associados à regulação de STL1 de W. anomalus LBCM105 e S. cerevisiae, sugerindo uma notável distinção entre os elementos putativos de ambos. A análise da arvore filogenética, construída a partir das sequências de proteínas Stl1 de diferentes leveduras, evidenciou uma maior similaridade entre o transportador putativo de W. anomalus LBCM105 e W. ciferrii, e uma maior distância em relação a S. cerevisiae. Após caracterização do gene STL1 de W. anomalus LBCM105, foram realizados análises da expressão gênica deste em condições de cultivo contendo glicose ou glicerol, como fonte de carbono. O gene STL1 apresentou uma expressão 23,76 vezes maior em glicerol em relação à condição de meio contendo glicose. A avaliação do transporte de glicerol pela W. anomalus LBCM105 evidenciou um transporte ativo em condições de cultivo contendo glicose ou glicerol, no entanto, Stl1p foi induzida em presença de glicerol. Os resultados apresentaram dados relevantes quanto à possível identificação do transportador de glicerol em W. anomalus LBCM105, evidenciando um potencial significativo na aplicação biotecnológica quanto ao consumo de glicerol bruto, resíduo da indústria de biodiesel, uma vez que demonstrou ser bastante eficiente na captação de glicerol.

Os biocombustíveis, bioetanol e biodiesel, estão entre as fontes de energia alternativas promissoras para reduzir a utilização dos combustíveis fósseis. O biodiesel é um éster metílico ou etílico obtido a partir da transesterificação de óleos vegetais na presença de um álcool. Esta reação gera como subproduto, o glicerol bruto (GB), que equivale a 10% de todo volume gerado. Uma alternativa para o consumo do GB é a sua utilização como fonte de carbono por micro-organismos oleaginosos. Os óleos estocados podem ser utilizados como uma fonte alternativa de óleos para produção do biodiesel. Os micro-organismos oleaginosos são capazes de acumular mais de 20% de sua biomassa em lipídeos e seus óleos apresentam estrutura química semelhante aos óleos vegetais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi selecionar leveduras capazes de metabolizar o glicerol bruto e estocá-lo na forma de lipídeos. Sessenta e três isolados de leveduras oriundas da produção de cachaça foram avaliados quanto à capacidade de crescer na presença de GB, como única fonte de carbono, e armazená-lo na forma de lipídeos. As leveduras foram inoculadas em meio mínimo Synthetic Defined (SD) contendo 10% de GB e incubadas a 23°C, durante um período de 48 horas. No ensaio colorimétrico com Sudan Black (corante lipofílico) as culturas foram fixadas em lâminas e analisadas em microscópio óptico. Vinte e cinco cepas foram selecionadas como leveduras capazes de armazenar lipídeos. Posteriormente, estas cepas foram submetidas a ensaio quantitativo utilizando o corante fluorescente Nile Red. Para isso, foram inoculadas em meio SD com 10% de GB, incubadas a 28°C, sob agitação de 180 RPM, por 48 horas e colocadas em solução Nile Red 0,1 mg/mL por 10 minutos. Seis leveduras apresentaram o dobro da acumulação de lipídeo em comparação a Yarrowia lipolytica (controle positivo). Estas cepas foram posteriormente submetidas à caracterização dos ácidos graxos produzidos, na cromatografia gasosa-Flame Ionization Detector (CG-FID). A cepa LBCM3 apresentou o maior conteúdo lipídico dentre as selecionadas com 36,60% de lipídeos. Além disso, esta foi a única cepa capaz de produzir simultaneamente os ácidos linoléico e linolênico, lipídeos estes importantes para produção de biodiesel. A cepa LBCM17 apresentou o segundo maior conteúdo lipídico com 27,90% de lipídeos totais. As cepas LBCM95 e LBCM98 exibiram 21,90% e 2,17% de lipídeos totais, respectivamente. A LBCM1 apresentou o menor conteúdo lipidíco com 0,22% de lipídeos totais. Os resultados demonstram que as leveduras selecionadas são capazes de utilizar o GB como fonte de carbono e possuem potencial para aplicação na produção de biodiesel. As seis leveduras selecionadas na análise semi-quantitativa, segundo resultado do sequenciamento da região ITS5.8s, são Saccharomyces cerevisiae.

Para manter sua capacidade produtiva, as células de leveduras precisam adaptar-se às mudanças ambientais que ocorrem durante o processo produtivo. A resposta a baixo pH é de interesse, pois tal exposição ocorre sob condições industriais como no tratamento ácido para redução de contaminação bacteriana antes da reciclagem celular em processos fermentativos. Semelhante à resposta a ácidos orgânicos, a resistência a ácidos inorgânicos envolve mudanças da permeabilidade de membrana, extrusão ativa de H+ e modulação da expressão gênica. O presente trabalho estudou a participação do íon cálcio na resposta ao estresse ácido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos mostram elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ desencadeada por pulso ácido e que esta mudança decorre do influxo de cálcio extracelular e da mobilização vacuolar do íon. Testes de viabilidade celular sugerem que a tolerância da S. cerevisiae a estresse ácido envolve a ativação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e consequente regulação da expressão de alguns genes mediada pelo fator de transcrição Crz1p/Tcn1p. A tolerância dos mutantes nulos da via de sinalização da quinase Snf1p, responsável pela utilização de fontes alternativas de carbono, foi menor em relação à cepa parental BY4741, sugerindo a participação desta via na resposta a baixo pH. Em conjunto, os resultados mostram a importância das vias de sinalização da fosfatase calcineurina e da quinase Snf1p para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido.

A cachaça é uma bebida destilada obtida do mosto de caldo de cana fermentado e surgiu no início da colonização quando a produção de açúcar era uma das principais atividades econômicas do Brasil. O processo produtivo da cachaça de alambique se divide em duas etapas, sendo que primeiramente faz-se o preparo do inóculo, conhecido como “pé-decuba”, e a segunda etapa refere-se à fermentação propriamente dita, onde ocorre o metabolismo do açúcar pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, formando álcool, dióxido de carbono e compostos secundários. Durante o cultivo da cana-de-açúcar, matéria prima utilizada para extração do caldo para fermentação, práticas de cultivo, como adubações nitrogenadas e capinas químicas são executadas; já no preparo do pé-de-cuba produtos de origem vegetal, como fubá de milho e quirela de arroz, são rotineiramente incorporados. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da adubação nitrogenada e uso de herbicida no cultivo da cana-de-açúcar, da adição de cereais e do tratamento térmico do caldo sobre a fermentação e a composição química da cachaça. Inicialmente foi implantada no IFNMG-Campus Salinas uma área de aproximadamente 1,0 hectare com a cana híbrida RB765418. Posteriormente este canavial foi subdividido em parcelas e aplicadas todas as práticas de cultivo de capinas manual e químicas versus adubações com sulfato de amônio e uréia, totalizando oito tratamentos. Para avaliar os efeitos destas práticas de cultivo sobre a fermentação do mosto em escala piloto, foram utilizados oito dornas de fermentação de 50L, em ambiente controlado, contendo em cada uma caldo de cana-de-açúcar extraído das plantas de seus respectivas tratamentos e uma cepa de Saccharomyces cerevisiae selecionada da região de Salinas/MG, durante 10 dias consecutivos. Para avaliar os efeitos do fubá de milho e da quirela de arroz foram utilizadas quatro dornas de fermentação e para o tratamento térmico mais três dornas, todas conduzidas nas mesmas condições anteriores. Foram analisados parâmetros fermentativos como o consumo de sólidos solúveis totais, grau alcoólico e acidez total do mosto. A dorna com mosto proveniente de caldo de cana submetidas às práticas de cultivo: fertilização com sulfato de amônio e capina química apresentou uma elevação na acidez. Não houve diferença significativa entre a dorna controle (somente a levedura) e as dornas com adição de fubá de milho e quirela de arroz. Em relação ao tratamento térmico do caldo, independente do método de tratamento, as dornas apresentaram um menor consumo de sólidos solúveis totais (ºBrix), indicando uma fermentação mais lenta, e redução do grau alcoólico. Especificamente para a dorna com caldo pasteurizado houve uma elevação da acidez do mosto. Para os parâmetros físico-químicos foi constatada uma maior produção de álcool n-propanol nas dornas, cujo caldo foi extraído de canas submetidas a capina química, e quando associada à fertilização com sulfato de amônio houve redução na produção de álcool isoamílico. Foi verificado que o uso do fubá de milho e da quirela de arroz não interferiu nos parâmetros físico-químicos das cachaças destiladas. O tratamento térmico, independente do método empregado, reduziu a formação do álcool isoamílico das cachaças destiladas. Portanto, foi constatado que as práticas de cultivo e a adição de suplementos nutricionais utilizados neste trabalho, bem como o tratamento térmico do caldo de cana, não resultaram em benefícios que justifiquem suas aplicações na busca de incrementos e melhorias sobre a fermentação e a composição química da cachaça.

A fermentação é uma etapa importante no processo de produção da cachaça, conduzida por microrganismos como leveduras e bactérias, responsáveis pela produção dos principais compostos presentes na bebida. As leveduras, notadamente a Saccharomyces cerevisiae, são as principais responsáveis pela condução desta etapa. Dentre as bactérias presentes, as bactérias lácticas são as mais comumente isoladas. Estas bactérias tem sido descritas por causarem prejuízos à fermentação mas também relata-se sua importância na melhoria sensorial de vinhos, pelo do aumento de ésteres, em especial o lactato de etila. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da presença de bactérias lácticas isoladas da região de Salinas/MG no processo fermentativo conduzido por uma levedura selecionada, assim como nas características físico-químicas e sensoriais da bebida. Inicialmente foram isoladas bactérias lácticas oriundas de dornas de fermentação de produtores de cachaça da região de Salinas/MG para posterior caracterização molecular. A caracterização molecular foi realizada por análise de restrição enzimática (PCRARDRA) e confirmada pelo sequenciamento da região intergênica 16S-23S, identificando bactérias da espécie Lactobacillus casei e Lactobacillus perolens em apenas um isolado. Estes isolados foram submetidos a testes de crescimento, viabilidade e produção de lactato de etila para escolha da melhor bactéria para uso nos experimentos de fermentação em escala piloto. Para avaliar o efeito desta bactéria sobre a fermentação da cachaça, foram utilizadas quatro dornas de 50L, em ambiente controlado, contendo caldo de cana-de-açúcar de uma mesma cultivar e uma Saccharomyces cerevisiae selecionada da região de Salinas/MG, durante 10 dias consecutivos. Variou-se somente a presença, o inoculo e reinóculos da bactéria láctica, assim como o uso de caldo esterilizado. Foram analisados parâmetros fermentativos como a taxa de consumo de sólidos solúveis totais, grau alcoólico e acidez total do mosto. Não houve diferença significativa entre as dornas controle (somente levedura) e as dornas com adição de bactéria láctica (0h, reinóculos de 48h e caldo autoclavado com reinóculos), não afetando assim o desempenho da fermentação. Entretanto a dorna com reinóculos de bactéria a cada 48 horas utilizando caldo estéril teve um pior desempenho a partir do quinto dia, indicando uma fermentação mais lenta. Para os parâmetros físicoquímicos foi constatado que houve maior produção de lactato de etila na dorna com caldo autoclavado e reinóculos da bactéria láctica, mostrando que somente a adição e os reinóculos da bactéria não garantem necessariamente uma maior presença do lactato de etila. Pode-se constatar que a relação entre a cepa de levedura e a espécie de bactéria láctica é fator importante para a presença do éster em estudo. Os resultados de acidez volátil da cachaça indicam que a adição e os reinóculos de Lactobacillus casei não interferem nesse parâmetro e mostram que a autoclavagem do caldo gera uma cachaça mais ácida. Os resultados dos testes de aceitação das cachaças produzidas indicaram que os inóculos e reinóculos de Lactobacillus casei, assim como o tratamento térmico do caldo, não interferem na percepção sensorial dos atributos analisados pelos julgadores e consumidores.

Cachaça é a bebida alcoólica destilada mais consumida no Brasil. O aumento do consumo no mercado interno e a possibilidade de ampliação da exportação exigem um produto padronizado de qualidade. Por conseguinte, a busca pela qualidade exige procedimentos técnicos em toda cadeia de suprimentos, desde a plantação da cana-deaçúcar até práticas de destilação, incluindo a qualidade do processo de fermentação, inoculação de estirpes apropriadas em concentração adequada, reciclagem controlada e condições ambientais, todos são importantes para atingir essa padronização. Este trabalho visou à caracterização molecular e bioquímica de linhagens de Saccharomyces cerevisiae da região de Salinas (MG) para fins de Identificação Geográfica. Assim, foi isolado 7680 linhagens oriundas de 14 alambiques da microrregião de Salinas (MG), das quais selecionamos 18 linhagens de S. cerevisiae com características desejáveis para a produção de cachaça conforme metodologia desenvolvida (INPI-MG Protocolo-315). As linhagens selecionadas foram identificadas como S. cerevisiae pela análise com enzimas de restrição da região ITS (internal transcribed spacer region). Das dezoito linhagens selecionadas, 15 linhagens foram submetidas a um experimento em escala piloto, usando dornas com capacidade de 40 L por 10 ciclos consecutivos, avaliando o desempenho fermentativo como: consumo de sólidos solúveis, teor alcoólico e acidez do vinho, bem como os compostos voláteis presentes no produto final a cachaça. Das 15 linhagens testadas foram selecionadas seis para avaliar a repetibilidade dos resultados no ano seguinte. Das seis linhagens selecionadas, duas linhagens apresentaram melhor desempenho fermentativo e foram testadas em escala de produção, usando dornas com capacidade de 800 L, para avaliar o desempenho em escala de produção e a qualidade do produto final. Posteriormente as linhagens foram analisadas quanto à produção de alcoóis superiores e ésteres através de cromatografia gasosa, demonstrando que as linhagens produzem elevada quantidade de álcool superior. Foi realizado teste de aceitação das cachaças produzidas com as linhagens selecionadas. Para a caracterização molecular das linhagens em estudo, o polimorfismo do DNA das linhagens foi analisado com as técnicas de RAPD-PCR, COX-PCR e análises de microssatélites. Nossos resultados demonstraram que a análise de microssatélites permitiu uma nítida distinção dentre as linhagens analisadas, ao contrário das técnicas de RAPD-PCR e COX-PCR. Demonstrando, assim, ser necessário o uso de diferentes técnicas combinadas na análise do polimorfismo das linhagens. A caracterização molecular mostrou um polimorfismo entre as linhagens selecionadas e claras diferenças sobre linhagens isoladas de outras regiões de Minas Gerais, sugerindo uma forte correlação entre a origem geográfica e as características genéticas de linhagens de leveduras.

Kluyveromyces lactis é uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso é considerada como modelo alternativo para estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos de leveduras não Saccharomyces. Compreender os mecanismos de captação de lactose e a regulação envolvida no transporte é um passo importante para melhores aplicações biotecnológicas destas células. O transporte de lactose, em K. lactis é mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As células foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3% w/w)) a uma concentração de 2% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 ° C. As células foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por três vezes com água fria, resuspensas em 100 mM Tris / tampão de citrato, pH 5.0 para medições de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cinética da taxa inicial de captação de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentrações de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p também foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as células foram cultivadas em lactose e divididas em duas alíquotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As células foram colhidas, lavadas e a captação inicial de lactose foi medida. A taxa de captação inicial de [D-glucose-1-14C] lactose também foi investigada em células cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presença / ausência de cicloheximida ou Higromicina B. A localização do transportador Lac12-GFP foi investigada em células crescidas em glicose e em células transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de açúcares por células de K.lactis foi analisado através de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em células cultivadas em 2% de lactose obedece a uma cinética de saturação. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 ± 0,38 mM e a velocidade máxima (Vmáx) foi 953,47 ± 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em células cultivadas em galactose e glicerol. As células cultivadas em 2% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as células crescidas em glicose foram transferidas para 2% (w/v) de lactose, o transporte exibe recuperação parcial. Esta recuperação não parece requerer a síntese de proteínas uma vez que cicloheximida e higromicina B não impediram a desrepressão parcial. Além disso, o transporte de lactose não é inativado pela glicose. A localização sub celular do transportador Lac12 é dependente da fonte de carbono e da sua concentração. O consumo de glicose e lactose é simultâneo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose é preferencial ao de galactose quando os dois açúcares estão presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 é constitutivo e que a glicose exerce um controle não muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.

Em processos fermentativos, as células de leveduras são expostas a alterações ambientais, tais como alterações nos níveis de nutrientes, temperatura, pH, concentração de etanol, concentração de O2, e outras mudanças. A capacidade de responder às condições ambientais é importante para a funcionalidade e sobrevivência das células. Na literatura, são amplamente discutidos os problemas relacionados à resposta ao estresse por ácidos orgânicos fracos produzidos durante o processo fermentativo ou aqueles utilizados como conservantes e à micro-organismos competidores. A resposta ao estresse induzido por ácidos inorgânicos é pouco estudada uma vez que este ambiente é encontrado quando se reciclam células em processos industriais e quando se utilizam leveduras como probiótico. O objetivo deste trabalho foi investigar a importância das reservas energéticas ATP, trealose e glicogênio, na resposta ao estresse ácido inorgânico em diferentes linhagens de Saccharomyces. Os resultados obtidos mostram que as linhagens de Saccharomyces cerevisiae: var. boulardii, LBCM 479 (ena1-4 ) e UFMG 905 submetidas a um estresse ácido severo (pH 2), imposto pelo ácido inorgânico HCl, são mais tolerantes a essa condição do que a S. cerevisiae W303, que apresentou maior sensibilidade. Foi observado um consumo de ATP e mobilização de trealose ao longo da exposição ao ácido em todas as linhagens. A reserva de glicogênio não pareceu ser importante para a resposta ao ácido, no período de ensaio analisado, quando a trealose ainda se encontrava presente. Os dados sugerem que um dos fatores envolvidos na resposta a este estresse, em relação à viabilidade celular, relaciona-se ao conteúdo/mobilização de reservas energéticas, especialmente, do dissacarídeo trealose. Interessantemente, a linhagem W303 mostrou aumento das reservas de trealose e uma maior capacidade de sobreviver ao estresse ácido quando exposta ao HCl antes e depois de um estresse térmico moderado em fases de crescimento exponencial e estacionária. Um aumento das reservas de glicogênio ocorreu após o estresse térmico subletal apenas na fase estacionária. Provavelmente, essa resposta envolve também mudanças na expressão gênica. A sobrevivência em mutantes nulos tps1(subunidade do complexo trealose fosfato sintase/fosfatase), nth1 e nth2 (genes das trealases neutras), ath1 (gene da trealase ácida), assim como a atividade enzimática sugerem que esses genes são importantes para a resposta ao estresse ácido inorgânico. Em conjunto, os resultados sugerem que o conteúdo e a mobilização de reservas energéticas, principalmente de trealose, parecem estar envolvidos na resposta ao estresse por ácido inorgânico. Além disso, células de W303 submetidas a um estresse de temperatura subletal respondem melhor ao estresse ácido e, esta resposta coincide com uma maior mobilização de trealose.

Etanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.

A cerveja é uma bebida alcoólica produto da fermentação do malte de cevada por leveduras que vem sendo produzida desde, aproximadamente, 6000 anos a.C. Além de gás carbônico e etanol, as leveduras produzem durante a fermentação, compostos secundários que são responsáveis pela formação do flavour e consequente qualidade sensorial da bebida. Por isso o uso de leveduras selecionadas tem sido um aspecto de grande importância na obtenção de bebidas. Na fabricação da cerveja, podem ser utilizadas leveduras do tipo ale ou lager, que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. Estas espécies podem ser classificadas tanto por testes bioquímicos quanto por seu comportamento diferencial durante a fermentação. O Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP conta com uma coleção de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas a partir de dornas de fermentação de cachaça, as quais foram selecionadas por sua alta capacidade de produção de compostos voláteis e alta resistência a diferentes tipos de estresse. O presente trabalho objetivou a caracterização bioquímica e molecular de 21 cepas da coleção LBCM e a utilização de critérios de seleção visando à aplicação destas cepas à produção de cervejas. Das 21 cepas estudadas, 11 foram capazes de fermentar maltose, apresentando velocidade específica de crescimento semelhante em meio contendo glicose. A identificação molecular das cepas através da região ITS-5.8S do rDNA confirmou que 10 cepas pertencem à espécie S. cerevisiae. Dois grupos de testes foram aplicados posteriormente sobre as 10 cepas selecionadas e 4 cepas cervejeiras comerciais. O primeiro grupo de testes incluiu critérios de seleção baseados na classificação ale e lager, no perfil de floculação e na capacidade de crescer sob baixas temperaturas. O segundo grupo, incluiu testes complementares baseados na tolerância ao etanol, na produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e 4-vinilguaiacol (4-VG), no transporte de α-glicosídeos e na síntese de micocinas. Os resultados mostraram que três das 10 cepas estudadas foram capazes de fermentar melobiose e secretar melobiase, perfil característico de cepas tipo lager, embora todas as cepas tenham crescido a 37°C. Além disso, 9 foram capazes de crescer a 20°C e 7 a 15°C. Quanto ao perfil de floculação, 9 cepas apresentaram percentuais de floculação maior que 36% e responderam com um fenótipo New-Flo. A presença dos genes FLO1, FLO5 e FLO11 foi verificada por PCR e quantificada por qPCR, sendo relevante a presença dos genes FLO5 e FLO11 na maioria das cepas. Em geral, as cepas mais floculantes foram também as que apresentaram maior hidrofobicidade na sua superfície celular. Quanto aos testes complementares, as cepas apresentaram resistência a altas concentrações de etanol (20% (v/v)), baixa ou nenhuma produção de H2S (off flavour) e síntese de 4-VG em concentrações semelhantes às apresentadas pelas cepas comerciais tipo ale. Considerando a importância do consumo total dos açúcares presentes no mosto, em especial a maltotriose, o transporte de α-glicosídeos foi avaliado. As cepas apresentaram um transporte de α-glicosídeos semelhante aos valores revelados pelas cepas cervejeiras comerciais. Finalmente, as cepas foram submetidas a testes de produção e resistência a micocinas, considerando o uso de fermentações consorciadas. Os resultados revelaram que todas as cepas experimentais não são sensíveis, tampouco prejudiciais a outras espécies. Com base nos resultados dos testes complementares, foram selecionadas as cepas experimentais LBCM 45 e 78 para a produção de cervejas german pilsner e weissbier, respectivamente. As cervejas produzidas foram submetidas a análises físico-químicas, cujos resultados mostraram que as cepas em estudo, LBCM 45 e 78 apresentaram comportamento semelhante às cepas cervejeiras comerciais W-34/70 e WB-06. Portanto, os resultados do presente trabalho contribuíram para uma melhor caracterização da grande diversidade de linhagens de S. cerevisiae isoladas da produção de cachaça, visando sua potencial utilização na produção de outras bebidas alcoólicas fermentadas, tais como as cervejas, além da sua possível utilização em fermentações consorciadas.

Em uma economia movida pelo transporte, a dinâmica dos combustíveis líquidos faz parte de sua engenharia. A mudança do consumo de energia baseado em combustíveis fósseis para os de fontes renováveis é um desafio e uma necessidade de ordem econômica e ambiental. Uma vez que o petróleo é a principal fonte fóssil utilizada e possui reservas de fácil acesso limitadas, o consumo destas irá eventualmente exaurir sua oferta. Uma alternativa que tem mostrado-se promissora nos últimos anos é o uso dos Biocombustíveis. Dentre estes, o maior destaque é dado ao Bioetanol e Biodiesel. A partir do processo produtivo de Biodiesel industrialmente utilizado são obtidos ésteres monoalquílicos de ácidos graxos (Biodiesel) e co-produtos dos quais o mais importante é o glicerol. Muitos microrganismos são capazes de utilizar o glicerol como única fonte de carbono, e um exemplo são as leveduras. O objetivo deste projeto foi desenvolver um processo, industrialmente vantajoso, para utilizar um co-produto de baixo custo da produção de Biodiesel como base para meio de cultura para diferentes leveduras. Utilizou-se três linhagens de interesse comercial, Saccharomyces cerevisiae LBCM 653C (produtora de cachaça) e do fermento de panificação FLEISHMANN, e S. boulardii, e uma linhagem laboratorial, S. cerevisiae BY4741. Cresceu-se essas linhagens em diluições de resíduo glicérico bruto de Biodiesel fornecido pelo CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais/Belo Horizonte-MG) e pela BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA/Itaúna-MG). As diluições foram acrescidas de diferentes fontes nitrogenadas (YP – Extrato de levedura e Peptona, Sulfato de Amônio e Uréia) e analisadas quanto ao crescimento celular. As preparações nas quais obteve-se crescimento celular similar àquele obtido em meio laboratorial YPGlicerol foi com o acréscimo de YP como fonte nitrogenada, e o crescimento celular em resíduo diluído com ou sem a adição Sulfato de Amônio e Uréia não foi apreciável quando comparado àquele obtido com YP. Análise dos dados mostrou que o crescimento celular em cada preparação de resíduo de Biodiesel diluído depende da linhagem utilizada. Sugere-se que a manutenção do pH em valores mais baixos estimule o crescimento celular em resíduo de Biodiesel diluído. Além disso, a estocagem parece promover modificações no resíduo que inibem o crescimento celular da linhagem S. boulardii sob as condições ensaiadas. Devido ao fato de que as leveduras estudadas foram capazes de crescer em diluições de resíduo de Biodiesel, a utilização deste em processo biotecnológico com leveduras é viável.